Что заставляет нас «включаться» и работать? Что нас, так сказать, заводит? Ответ однозначен: ферменты. Эти вещества обеспечивают биохимические реакции во всех живых организмах. Они обязывают наше сердце биться, желудок – переваривать пищу, они расщепляют алкоголь, который мы пьем. Кроме того, ферменты также синтезируют каждый кусочек каждой клетки в теле, будь то вещества внеклеточного матрикса, скрепляющего наши клетки, или хромосома, где находится аккуратно упакованная молекула ДНК, или липидная оболочка – клеточная мембрана. Ферменты начинают вечеринку под названием «жизнь».
Если использовать химические термины, можно сказать, что ферменты ускоряют, или катализируют, реакции. Это звучит довольно обыденно, пока вы не осознали их потрясающую мощь. Они могут увеличить скорость естественной реакции двух веществ в 10 млрд раз. Процесс, который с участием фермента проходит за секунду, при его отсутствии будет длиться 317 лет. На человека работает около 10 000 разных ферментов. И хотя некоторые ферменты у нас уникальны, многие другие, обеспечивающие жизнедеятельность организма, так называемые «белки домашнего хозяйства», найдены у множества видов, от тигров до мухоморов. Они необходимы для поддержания работоспособности наших организмов.
Еще в XIX в. естествоиспытатели наблюдали в пробирках результат работы ферментов. Немецкий химик Эдуард Бухнер показал, что клетки дрожжей содержат фермент зимазу, который превращает раствор сахара в этиловый спирт и углекислый газ, выделяющийся на поверхность в виде пузырьков. Всем нам этот процесс известен как брожение.
Ученые очень давно заметили, что процессы, катализируемые ферментами, чрезвычайно специфичны. То есть, в отличие от обычных беспорядочных химических реакций, фермент очень избирателен, так что вступают в реакцию и образуются в результате нее строго определенные вещества. Исследователи измеряли скорость ферментативной реакции и могли предсказать ее изменения, например, при добавлении зимазы или сахара. Целые книги подробно описывали работу ферментов[70]. Однако примечательно, что научному сообществу не удавалось точно решить, из чего они состоят[71]. Это стало предметом долгих и противоречивых научных изысканий. На определенных этапах работа напоминала поиск вещества наследственности, завершившийся в итоге открытием двойной спирали ДНК. Как монах-августинец Грегор Мендель знал, что должна существовать некая дискретная единица наследственности, управляющая признаками его гороха, но не представлял, из чего она состоит, так и ученые знали, что существует мощное вещество, ускоряющее биохимические реакции, но не могли прийти к единому мнению, что это такое.
Джеймс Самнер занялся химией после того, как в юности он в результате несчастного случая на охоте потерял руку. В 1920 г. он предложил необычную для того времени теорию, согласно которой ферменты – это белки. В своей лаборатории в Корнеллском университете Самнеру удалось выделить и затем кристаллизовать фермент уреазу, который расщепляет мочевину (вещество в моче) на аммиак и углекислый газ. Как известно, кристаллы химически очень чистые; например, в кристаллах поваренной соли, которой вы посыпаете свой бургер, содержится чистый хлорид натрия. Когда анализ кристаллической уреазы показал, что она представляет собой чистый белок и сохраняет свою ферментативную активность, Самнер пришел к логичному выводу, что по своей природе этот фермент – белок. Но все равно по отношению к такому утверждению оставались скептики. Впрочем, в последующие три десятилетия парадигма менялась, по мере того как множество других ферментов были кристаллизованы и также оказались белками. В своей нобелевской лекции в 1946 г. Самнер без колебаний объявил то, что все уже приняли как факт: «Все ферменты – это белки»[72].
Через тридцать лет я, молодой исследователь, изучающий РНК, столкнулся с вопросом, может ли это фундаментальное положение быть в корне неверным. Если ответ утвердительный, то мне с другими учеными придется рассматривать РНК совершенно по-новому – не как переносчика информации от ДНК и пассивного участника синтеза белка, но как катализатор, который может управлять биологическими процессами.
В 1978 г., после окончания моей постдокторантуры в Массачусетском технологическом институте, я перешел на место профессора в Колорадский университет в Боулдере. Мне выделили исследовательскую лабораторию на третьем этаже весьма старомодного здания, где размещался химический факультет. Я собирался заниматься передовыми научными изысканиями, хотя лаборатория была как из XIX столетия, с потертыми столешницами из черного камня талькохлорита и лакированными дубовыми ящиками. Тем не менее в этой лаборатории я впервые работал в качестве самостоятельного ученого, поэтому она казалась мне великолепной.
Когда я оглядывал эту пустую комнату, то еще не имел ни малейшего представления о том, что мне предстояло открыть. Однако я понимал, что мне нужна помощь, поэтому первым делом решил пригласить на работу лаборанта-исследователя. На мое объявление в The Denver Post откликнулось около 30 кандидатов, но только у одного в рекомендательном письме было сказано: «У него золотые руки. Все эксперименты, которые он проводит, результативны». Арт Зауг работал в Уэслианском университете в штате Коннектикут, поэтому я проводил собеседование по телефону. И хотя я не мог предложить ему ни высокой зарплаты, ни гарантий длительной занятости, он принял мое предложение и переехал в Колорадо, чтобы начать работу с моим новым микроскопическим подопытным кроликом – тетрахименой (Tetrahymena), одноклеточным существом, обитающим в прудах.
В то время я, как и большинство биологов на Земле, все еще считал РНК своего рода посредником, играющим вторую скрипку при ДНК. Я был специалистом по ДНК: моя диссертация и последующая работа были посвящены двойной спирали. Однако в ходе исследований я все больше приближался к РНК. Когда я приехал в Боулдер, то пытался разобраться, как РНК копирует ДНК в процессе транскрипции. Клеточные ферменты превращали последовательность ДНК в РНК подобно тому, как средневековые монахи переписывали библейские тексты на чистый пергамент.
Общие принципы транскрипции были уже хорошо изучены на бактериях. Я же пытался понять, как транскрипция происходит у эукариотов – организмов, хранящих свою ДНК в ядре. Об этом я рассказал Арту, вводя его в курс дела. Множество фундаментальных исследований эукариотических клеток были выполнены на дрожжах, мушках дрозофилах или мышах, чьими генами легко управлять, либо на клетках и тканях человека, потому что это имеет медицинскую значимость. Меня не прельщали ни дрожжи, ни мушки, ни мыши, потому что каждый ген у них один из многих тысяч, настоящая иголка в стоге сена. А я хотел изучать единственный ген и его природных белковых партнеров, поэтому мне нужен был эукариотический организм, более подходящий для этой задачи.
И тут на сцену выходит тетрахимена – одноклеточный волосатый комочек, встречающийся в пресноводных прудах по всему миру. По форме она напоминает крошечный арбуз, покрытый ресничками, как шерстью. Она немного похожа на хомячка без мордочки и очень мило смотрится под микроскопом. Клетки тетрахимены очень быстро растут и делятся каждые три часа, следовательно, каждые три часа клетка должна удвоить количество содержащихся в ней белков. Для совершения такого подвига должно быть достаточное количество молекулярных фабрик белка – рибосом, поэтому каждая клетка тетрахимены содержит около 10 000 копий генов рибосомной РНК[73]. Сравните 10 000 копий одного гена с типичными для человека двумя копиями (одна от мамы, другая от папы), и вы поймете, почему эта малышка привлекла мое внимание. Гораздо проще найти иголку в стоге сена, если таких иголок там 10 000. У генов рибосомной РНК тетрахимены есть еще одна удивительная особенность. По какой-то неведомой причине они находятся на коротких фрагментах ДНК, а не располагаются бок о бок с другими генами как часть гигантской хромосомы. Поэтому можно выделить гены рибосомной РНК неповрежденными, что практически нереально при работе с хромосомами человека, которые длиннее в тысячи раз[74]. Казалось, ДНК тетрахимены лежала упакованная и перевязанная ленточкой в ожидании ученых, которые придут и заберут этот подарок.
Нашей целью было понять, как РНК транскрибируется с гена тетрахимены и как специальные белки эукариотических хромосом, связанные с ДНК, регулируют этот процесс. Арту с его золотыми руками не потребовалось много времени, чтобы начать работу. Он проводил эксперименты с изумительной точностью, оказавшись, таким образом, ценным помощником для студентов. Вскоре они выстраивались в очередь, чтобы использовать его буферные растворы, ведь все знали, что раствор, приготовленный Артом, точно будет работать, а раствор, сделанный ими самостоятельно… должен бы работать. Когда кто-то в лаборатории готовил свои результаты к публикации, он мог попросить Арта воспроизвести ключевой эксперимент «в последний раз», потому что, какими бы точными ни были их собственные данные, результаты Арта будут безупречны.
Вскоре мы обнаружили, что изучаемый ген тетрахимены содержит один небольшой интрон, длиной около 400 пар оснований[75]. Сначала мы решили, что это просто еще один случай, когда бессмысленное «бла-бла-бла» прерывает важные значимые участки гена, аналогично тому, что двумя годами ранее Фил Шарп и Рич Робертс описали для мРНК. У нас были рибосомные РНК (рРНК), а не мРНК, но мы полагали, что в общих чертах это одна и та же схема. И хотя ученые не могли прийти к единому мнению, откуда в гене взялись интроны, мы были уверены, что их необходимо оттуда удалить. Всякий раз, когда ген копировался в виде РНК, интрон необходимо было аккуратно вырезать, чтобы получить функциональную молекулу РНК, независимо от того, была ли это мРНК, кодирующая белок, или рРНК, которая входит в состав синтезирующей белок рибосомы.
Как специалиста по ДНК меня не особо интересовали интроны. Вместо этого я старался понять процесс транскрипции. Наш первый вопрос был простым: можем ли мы с Артом наблюдать, как РНК копируется с ДНК?
В первых экспериментах мы не стали физически изолировать гены рибосомной РНК тетрахимены. Вместо этого мы использовали волшебный грибной соус. Арт выделил ядра из клеток тетрахимены и добавил к ним немного токсина из красивого мухомора с красной шляпкой. Конечно, этому ингредиенту не место в говядине по-бургундски, но для нашей биохимической кухни у него были полезные свойства. Этот токсин отравлял РНК полимеразы – ферменты, которые производят мРНК и тРНК, но не трогал фермент, синтезирующий рРНК. Таким образом, мы могли быть уверены, что любые РНК, образующиеся в нашей пробирке, будут синтезированы только с генов рРНК. В наше биохимическое блюдо также были добавлены радиоактивные нуклеотиды, которые встраивались в любые синтезированные в ядре молекулы РНК, что позволяло отслеживать РНК на протяжении всего эксперимента. Затем мы смешали всё вместе и оставили пробирки на час, чтобы успела образоваться РНК.
После этого Арт использовал электрофорез в геле для анализа полученной РНК. Гель представляет собой фрагмент желеобразной (студенистой) субстанции; когда в нем создается электрическое поле – а именно отрицательный электрод размещается сверху, а положительный снизу, – отрицательно заряженные молекулы РНК протискиваются сквозь гель. Мелкие молекулы способны прокладывать себе путь через гель быстрее, чем крупные, поэтому молекулы РНК одинаковых размеров группируются в геле в виде отдельных полосок.
Затем Арт убрал гель в темную комнату, положил на него лист рентгеновской пленки, оставил на ночь и следующим утром проявил. На пленке появилось изображение, поскольку молекулы РНК были помечены радиоактивными изотопами и каждая полоска РНК засвечивала соответствующий участок пленки. То есть ту же пленку, с помощью которой врач может определить, сломана ли у вас кость, используют и для получения изображения РНК в геле.
Мы с Артом надеялись увидеть рибосомную РНК, и действительно, на рентгеновской пленке она была заметна в виде темной полоски. Но мы с удивлением обнаружили и значительно меньший участок РНК, длиной около 400 оснований. Что это могло быть? Еще несколько экспериментов, и Арт точно установил, что это был интрон РНК, который каким-то образом «выпрыгнул» из большой РНК, образовавшейся в нашей пробирке в результате транскрипции.
Внезапно наш интерес к интронам резко возрос. В то время ученые активно задавались вопросом, как именно интроны вырезаются из РНК, а нам, видимо, посчастливилось запечатлеть этот процесс в действии. Чтобы понять механизм любого биохимического процесса, надо прежде всего заставить его протекать вне организма, то есть в лабораторной пробирке, где можно контролировать все компоненты реакции. Чтобы этого добиться, часто требуются годы, но у нас сплайсинг РНК тетрахимены происходил каждый раз, когда мы синтезировали РНК. Казалось, РНК отвела нам места в первом ряду, чтобы мы могли наблюдать за спектаклем сплайсинга.
Мы подумали, что сплайсинг катализируется белковыми ферментами. Ведь вырезанный интрон был всегда одинаковой длины, что предполагало работу очень точного фермента, а, как утверждал Самнер, «все ферменты – это белки». Поэтому мы с Артом разработали эксперимент, который позволял бы найти фермент или ферменты, поскольку их могло быть два: один вырезал интрон, другой склеивал полезные фрагменты РНК вместе. Мы знали, что сплайсинг совершается внутри ядра тетрахимены. И знали, что сплайсингу подвергается новообразованная РНК. Итак, для начала мы сумели выделить РНК перед тем, как пройдет сплайсинг, чтобы в этих молекулах еще оставались интроны. А затем взяли пробирку и смешали там несплайсированную РНК и разрушенные ядра тетрахимены. Мы запустили РНК в гель и наблюдали сплайсинговую активность с помощью рентгеновской пленки.
Когда Арт впервые попробовал провести этот эксперимент, мы с восторгом увидели, что интрон, размером в 400 оснований, вырезается из большой молекулы рРНК. Для науки это было непривычно – так быстро воссоздать естественный процесс в лабораторных условиях. Нашему другу Джону Абельсону из Калифорнийского университета в Сан-Диего потребовалось четыре года изнурительной работы, чтобы получить сплайсинг мРНК дрожжей в пробирке[76].
Но что-то здесь было не так. Как и любой опытный ученый, Арт предусмотрел ряд проверочных действий, которые помогали убедиться, что наблюдаемая реакция проходит надлежащим образом. В хорошем контрольном эксперименте исключают один из компонентов биохимического рецепта, оставляя все остальное без изменений. Если бы экспериментом было выпекание кекса, то в качестве контроля можно было бы исключить только муку, только яйца или только шоколад. Довольно скоро пекарь убедился бы, что мука и яйца – необходимые компоненты, а шоколад – дополнительный, что укрепило бы его представления о себе как о человеке, понимающем, что нужно, чтобы испечь кекс. В эксперименте Арта со сплайсингом РНК хорошим способом контроля было исключить ядра тетрахимены из реакции, потому что именно они, предположительно, служили источником белков, катализирующих реакцию сплайсинга. Мы ожидали, что в опыте без ядер ничего не произойдет. Однако удивительным образом сплайсинг сохранился. На рентгеновской пленке отпечатывалась яркая и четкая полоска, соответствующая интрону в 400 оснований, так, словно для сплайсинга не требовалось никакой помощи ферментов.
Первоначальный эксперимент по поиску ферментов, катализирующих сплайсинг рибосомной РНК у тетрахимены, дал неожиданный результат. Предполагалось, что для сплайсинга РНК требуется добавление экстракта ядер, где содержатся ферменты сплайсинга, но с помощью электрофореза в геле (методики, позволяющей разделить мелкие и крупные фрагменты РНК) было выявлено, что сплайсинг РНК происходит как в присутствии экстракта (правая дорожка), так и без него (средняя дорожка). Возник вопрос: чем же катализируется эта реакция в отсутствие фермента?
Это было не просто странно – это было неслыханно. Откройте любой учебник того времени для старшеклассников или для студентов колледжа, и вы узнаете, что только белковые ферменты катализируют реакции в клетке. Удивительно, но у нас этот процесс шел там, где присутствовала лишь РНК. Так ли это? Следующий год я все еще сомневался: вдруг какой-либо белковый фермент тетрахимены остался соединенным с РНК во время ее очистки – и как раз он отвечал за проведение сплайсинга, который мы наблюдали в наших пробирках. Если наша РНК была загрязнена белком, то нам, конечно, нельзя было утверждать, что РНК может катализировать свой собственный сплайсинг. Возможно, нам просто нужно было найти способ избавиться от гипотетического белка, и тогда РНК перестала бы самостоятельно сплайсироваться, а мы могли бы вернуться к поиску фермента сплайсинга.
В тот момент я поступил так, как должен поступать любой хороший ученый, – я направился туда, куда указывали результаты. Эта дорожка вскоре привела меня в маленький мир науки о РНК. Из специалиста по ДНК я должен был стать специалистом по РНК. Тогда я еще этого не понимал, но такой прыжок с корабля стал важнейшим решением в моей жизни.
Пока мы с Артом продолжали исследовать реакцию сплайсинга, новая аспирантка нашей лаборатории Пола Грабовски сделала еще одно неожиданное открытие. Мы все еще сомневались, что РНК действительно может заниматься сплайсингом самой себя, но Пола получила не менее странный результат. Парадоксально, но, когда появилось второе наблюдение, которое тоже казалось чем-то космическим, мы успокоились, поскольку стало ясно, что мы не были некомпетентными или сумасшедшими.
Пола не собиралась находить что-то новое, скорее, новое само нашло ее. Она решила запустить реакцию сплайсинга РНК при температуре 39 °C, а не при стандартных 30 °C. Тетрахимена может расти при обоих значениях температуры. Но теперь вместо одного вырезанного интрона Пола увидела два. И с интроном нового вида происходило нечто странное. В ходе электрофореза в геле новый интрон двигался крайне медленно. Создавалось впечатление, что этот фрагмент РНК был необычной формы, из-за чего и замедлялось его перемещение в геле.
Своим поведением во время электрофореза интрон определенно напоминал кольцевую или, возможно, разветвленную молекулу, хотя кольцевые РНК встречались редко и считалось, что они характерны только для вирусов или для похожих на вирусы инфекционных РНК. Пола получила ряд данных в пользу того, что новый интрон действительно был кольцевой формы. Но мы не могли утверждать это со всей определенностью, пока не увидели кольцевую РНК хотя бы мельком в электронный микроскоп. А поскольку я был единственным в лаборатории специалистом по этой технике, задача легла на меня.
К тому времени прошло уже два года, как я организовал лабораторию и принял на работу Арта. Весь день я был занят преподаванием, поэтому в лаборатории работал в основном по ночам. Я зафиксировал полученные Полой образцы РНК на диски диаметром 3 мм с медной сеточкой и забронировал вечернее время для работы на одном из университетских электронных микроскопов. Когда я включил в темной комнате высоковольтный регулятор, флуоресцентный экран осветил мое лицо зеленоватым сиянием, как на Хэллоуин. Я заглянул в окуляр и с восторгом увидел маленькие пончики – крошечные колечки РНК, покрывавшие сеточку[77]. Увидеть – значит поверить! Надо признаться, кольцевая РНК интрона в то время казалась скорей диковинкой, а не научным прорывом. Потребовалось много работы, прежде чем мы поняли ее значимость.
Тем летом меня пригласили выступить с докладом о моих новых исследованиях, относящихся к РНК, на престижной конференции по нуклеиновым кислотам в Нью-Хэмпшире. Это была редкая возможность для старшего преподавателя. Во время отъездов я всегда звонил в лабораторию, чтобы быть в курсе экспериментов и при случае помочь советом. Когда я разговаривал с Полой на следующий день после приезда, то ощутил в ее голосе скрытое волнение. Пола выделила линейную форму интрона тетрахимены сразу после того, как он был вырезан из большой РНК. Она обнаружила, что, пока интрон находился в пробирке, он сам по себе начинал сворачиваться в кольцо. Во всех предыдущих исследованиях требовалось, чтобы заставить РНК свернуться в кольцо, добавить белковый фермент, который склеивал два конца молекулы. Замыкание (кольцевание) не происходило самопроизвольно.
Я не готов был разделить с Полой ее воодушевление, а реагировал скорее недоверчиво и слегка раздраженно. Стоит ли обращать внимание на слова неопытной аспирантки, явно говорившей о чем-то совершенно нереалистичном и связанном, очевидно, с какой-то грубой ошибкой? Тем более накануне моего выступления перед глубокоуважаемым научным сообществом? Я совершенно не собирался в предстоящем докладе упоминать эти нелепые новые данные.
Однако, вернувшись в Боулдер, я убедился, что казавшийся невероятным результат Полы не был случайным. Он был полностью воспроизводим. Таким образом, в моей молодой лаборатории были получены два результата, которые опровергали все учебники: по-видимому, РНК сама себя выреза́ла в отсутствие какого-либо явного источника ферментов, а вырезанный интрон сам по себе сворачивался в кольцо, опять же в отсутствие каких-либо ферментов. Как такое могло происходить?
К концу 1981 г. мы понимали реакции сплайсинга и циркуляризации РНК вплоть до поведения отдельных атомов фосфора и кислорода[78]. Но с катализатором мы оказались точно в такой же ситуации, в какой были специалисты по ферментам в 1917 г. до работы Джеймса Самнера. Мы знали, что происходит, но совершенно не представляли почему. Чтобы РНК могла самопроизвольно вырезаться и затем сворачиваться в кольцо, процесс должен был длиться несколько тысяч лет. И даже тогда это не совершалось бы с такой высокой точностью, какую мы наблюдали. Должен существовать катализатор.
Как вскоре выяснилось, он был прямо перед нами.
В тот год на рождественской вечеринке химического факультета Пола подарила мне маленький собственноручно сделанный сувенир. Это была пластмассовая ромашка, на лепестках которой она аккуратно вывела чередующиеся надписи: «Это белок» и «Это не белок». В этом и заключалась наша дилемма.
РНК, которую мы использовали в наших экспериментах, прошла этапы тщательной очистки от белков. Эта хорошо известная процедура похожа на очистку одежды от трудновыводимых пятен. Мы стираем одежду в горячей воде, потому что высокая температура разворачивает и делает неактивными белковые цепочки. Мы используем моющие средства, которые тоже разворачивают белки. Мы можем даже обработать одежду стиральным порошком с биологически активными добавками, потому что есть хорошо известные ферменты, которые разрушают любой другой встретившийся белок. Наша РНК прошла все эти этапы и все равно продолжала вырезаться и сворачиваться в кольцо. Все доказательства опровергали гипотезу, что наши образцы были загрязнены каким-то белком. Однако, понимал я, как только мы заявим, что в пробах нет белков и сама РНК способна выполнять эти трюки, сразу найдется скептически настроенный коллега, который заявит, что он или она когда-то слышали о белке, способном пережить все воздействия, используемые нами при очистке.
Гадание на ромашке не тот способ, который позволит ответить на вопрос, нужен ли для сплайсинга рибосомной РНК тетрахимены белковый фермент
Чтобы мы могли уверенно исключить загрязнение тетрахимены белками, нужно было без ее участия создать не подвергшуюся сплайсингу РНК с интронами. Если бы в искусственно созданной РНК сплайсинг проходил в тех же самых местах молекулы, что и в живой клетке, то мы могли бы заявить, что эта РНК сама себе катализатор. И если бы это оказалось правдой, то могло бы перевернуть наши представления не только о химической природе ферментов, но и о способностях РНК.
В то время генная инженерия только зарождалась, и наша лаборатория еще не освоила эту технологию. Нам нужно было провести такие же манипуляция с генами, которые теперь используют биотехнологические компании, когда создают новые лекарственные препараты. Мы должны были обмануть бактерию кишечной палочки E. coli, так чтобы она синтезировала ген рибосомной РНК тетрахимены. Для этого встроили ДНК тетрахимены в плазмиду – маленькую кольцевую молекулу ДНК, которая может реплицироваться в бактериальной клетке. Таким образом мы превратили E. coli в чашках Петри в своего рода генетический копировальный аппарат, дающий столько копий нужного гена, сколько нам необходимо для работы.
Ныне для проведения такого эксперимента аспиранту в моей лаборатории потребовался бы день, но в 1982 г. доведение процесса до совершенства заняло у нас много месяцев. После того как мы наконец получили безупречно чистый ген, который никогда не бывал внутри клетки тетрахимены, нам еще требовалась РНК-полимераза, чтобы преобразовать генетическую информацию в РНК. Мне повезло, что моя жена Кэрол была специалистом по очистке E. coli РНК полимеразы. И она дала недостающий компонент. (Иногда полезно быть женатым на коллеге-биохимике, хотя, уверен, Кэрол поделилась бы этой штукой, даже не будучи моей женой.)
После того как Арт Зауг синтезировал РНК с искусственно созданного гена, он с помощью отточенной до совершенства процедуры избавился от единственного белка, который мы добавили в эксперименте, – РНК-полимеразы. Затем поместил все необходимые компоненты в нужной концентрации в пластиковые пробирки и запустил реакцию сплайсинга. Опять же, это немного напоминает выпечку: у вас есть рецепт, где перечислены мука, сахар, яйца, разрыхлитель и вода. В нашем случае в рецепт входили РНК, некоторые общие для всех клеток соли и один из четырех составных элементов РНК гуанозин – буква Г в алфавите РНК. Как и прежде, продукты реакции РНК были разделены с помощью электрофореза в геле и проявлены на рентгеновской пленке.
Мой друг профессор Ян Энгберг из Копенгагена, который несколько лет назад помог мне познакомиться с тетрахименой, по случаю навестил нас в Боулдере, как раз когда мы проводили эксперимент и проверяли, может ли искусственно созданная бактериальная версия РНК тетрахимены повторить свой трюк. Я до сих пор помню реакцию Яна, когда он увидел только что проявленную пленку. Интрон длиной 400 оснований вырезал сам себя из РНК большего размера, образовав четко различимую полосу на геле. На этот раз мы были уверены, что тут не задействован никакой белковый фермент[79]. Голос Яна чуть сел, он поднял глаза и произнес со своим чудесным датским акцентом: «Вы это сделали».
Теперь настало время повеселиться. Как нам следовало назвать эту удивительную РНК? Я выделил на лабораторной доске место для конкурса названий, и за неделю там появилось множество вариантов. Среди них была неизбежная sexРНК (от англ. self-excising – «самовырезающаяся РНК»). Также был «циркулон» – новый супергерой, способный превращать себя в кольцо. Затем предлагали «АРНзим» – от французской аббревиатуры для РНК – ARN (Acide ribonucléique) – и «энзим» (синоним слова «фермент»), чтобы получить составное слово, которое произносить легче, чем «РНАзим»[80]. Один вариант был явно лучше прочих – рибозим, рибонуклеиновая кислота с энзимной (ферментативной) активностью. Тот факт, что эта РНК не только вырезала себя, но и сворачивалась в кольцевую форму, убедил нас, что она действует как фермент и у нее достаточно мощности, чтобы продолжать работать даже после окончания реакции сплайсинга.
Конечно, было дерзостью с нашей стороны взять такой обобщающий термин. У нас был лишь один пример, а мы выбрали название для целого класса веществ. Но я не видел в этом особой опасности. Если второго примера так и не найдут, то наше открытие останется занятным исключением, и неважно, как мы его назвали. А вдруг тетрахимена явила всему миру лишь первый образец большой группы активных молекул РНК?
Потребовалось совсем немного времени, чтобы ответить на наш вопрос утвердительно. Не прошло и нескольких месяцев после нашей публикации в декабре 1982 г. о самосплайсирующейся РНК, как я услышал, что коллеги из Сент-Луиса, Амстердама и Олбани открыли интронные рибозимы у грибов[81], пекарских дрожжей[82] и даже вирусов-бактериофагов[83]. Последнее противоречило «правилу», согласно которому РНК-сплайсинг характерен только для эукариотов. Как только ученые узнали о существовании РНК, катализирующих свои собственные реакции, они начали находить их повсюду в природе.
Казалось, РНК, способные к самосплайсингу, разрушали одно из главных положений в биологии – что все ферменты являются белками. Нельзя тем не менее сказать, что Самнер был так уж далек от истины. Большинство ферментов действительно белки. Вместе с тем благодаря всем этим РНК с самосплайсингом возникло предположение, что в древности, до наступления эры белков, катализаторами были именно рибозимы.
Возникла также и другая гипотеза: возможно, в природе могут существовать еще не открытые РНК-катализаторы, осуществляющие разнообразные и поразительные реакции, считавшиеся прежде уделом исключительно белков. И действительно, буквально в двух шагах ждал своего открытия совершенно иной тип РНК-катализатора.
В отличие от богини Афины, которая появилась из головы Зевса полностью сформированной и во всеоружии, молекулы РНК транскрибируются с ДНК не сразу в активной форме. Прежде чем приступить к работе, они должны пройти ряд преобразований, или процессинг. Сплайсинг, при котором вырезаются интроны и соединяются оставшиеся участки, пусть и впечатляющая, но лишь одна из реакций РНК-процессинга. Другие события процессинга происходят на концах свежесинтезированной РНК или рядом с ними. При этом могут удаляться ненужные последовательности и добавляться нуклеотиды, не закодированные в ДНК.
Хороший пример такой обработки – транспортная РНК, адаптер, который одним концом распознаёт кодон на мРНК, а на другом несет соответствующую аминокислоту. В изначальной молекуле, полученной в результате транскрипции, присутствует дополнительный участок РНК в начале последовательности, который необходимо отрезать, с точностью до конкретного основания, чтобы получить функциональную тРНК. Фермент, который разрезает РНК, называется рибонуклеаза (или РНКаза), а тот фермент, который отрезает дополнительный участок тРНК, – рибонуклеаза P (где P – от англ. processing). РНКазу P открыл Сидни Олтмен, когда он был постдоком в английском Кембридже и работал в той самой лаборатории, которая дала нам Фрэнсиса Крика и Сида Бреннера.
Рибонуклеаза P, которая у кишечной палочки состоит из молекулы РНК (показана на рисунке) и связанных с ней белков (не показаны), расщепляет молекулу – предшественник тРНК в определенном месте, чтобы получился правильный конец тРНК
Позже в своей собственной лаборатории Йельского университета Сид Олтмен продолжил изучение РНКазы P. Она оказалась очень любопытным ферментом. Всякий раз, когда его выделяли из кишечной палочки, используя технологии для очистки белков, которые совершенствовались на протяжении десятилетий, в ферменте присутствовали надоедливые молекулы РНК. Аспиранту Сида Бену Старку пришлось очищать РНКазу P для своей диссертации. Над ним много подшучивали из-за того, что он не мог убрать РНК из выделяемого фермента[84]. Ведь все ферменты – белки, а грамотный аспирант должен уметь выделить чистую РНКазу P без примесей РНК. Однако Старку хватило опыта и уверенности в себе, чтобы отвергнуть мысль о некомпетентности, и в итоге он провел эксперименты, которые убедили Сида и диссертационный совет, что РНК – необходимый компонент для ферментативной активности РНКазы P[85]. Когда удалось получить отдельно РНК и белок, то оба эти компонента потребовалось опять смешать, чтобы фермент смог снова разрезать тРНК. В тот момент ученые думали, что не переписывают главное правило о ферментах, а лишь дополняют его. Они считали, что именно белковый компонент системы, а не РНК отвечает за протекание реакции.
Так зачем же РНКазе P нужны и белок, и РНК[86]? Разобраться в этом помогла счастливая случайность. Лаборатория Олтмена совместно с лабораторией Нормана Пейса в Колорадо провели ряд экспериментов по молекулярному комбинированию. Сид выделил РНК и белок из РНКазы P кишечной палочки, а Норман выделил те же два компонента из ее довольно дальней родственницы – сенной палочки (Bacillus subtilis). Ученых интересовало, будут ли обладать ферментативной активностью межвидовые комбинации, например РНК из кишечной палочки вместе с белком из сенной палочки. Решающий эксперимент был проведен научным сотрудником лаборатории Сида Сесилией Герье-Такада в пятницу, 23 сентября 1983 г. Сесилия была прекрасным ученым и при работе добавила несколько контрольных опытов, так же как сделал Арт в моей лаборатории. И, главное, она решила перепроверить отдельно реакции РНК-компонента и белка, которые раньше давали отрицательный результат. Она была уверена, что и сейчас не последует никакой активности[87].
Однако в этот раз все было по-другому. Норман по телефону предложил Сиду добавить немного больше хлорида магния – обычной соли, которая встречается во всех живых клетках[88]. Многие повара, увидев рецепт в кулинарной книге, могут его немного поменять и посмотреть, станет ли пирог вкуснее, если добавить пару лишних яиц или положить чуть меньше сахара. Так и Сесилия наряду со стандартным протоколом попробовала вариант с чуть измененными условиями. Она смешала молекулу – предшественник тРНК с разными РНК и белковыми компонентами РНКазы P, затем с помощью гель-электрофореза отделила от других продуктов реакции предшественник тРНК, положила на гель рентгеновскую пленку и оставила всё на ночь.
Когда в субботу она проявила пленку, то увидела, что, как обычно, предшественник тРНК был разрезан в нужном месте РНКазами P, взятыми и у кишечной палочки, и у сенной палочки. Она получала такой результат десятки раз. Но затем – о чудо! В растворе из пробирки, содержавшей только РНК-компонент РНКазы P, без белкового партнера, с доброй щепоткой магниевой соли, произошла точная обрезка предшественника тРНК[89]. То есть РНК сама по себе проявляла свойства фермента, в то время как отдельно белковый компонент был неактивен.
Немедленно осознав революционное значение своего результата, Сесилия, прежде чем рассказывать о нем кому-либо, решила удостовериться, все ли корректно. Она поставила повторный эксперимент в ту же субботу, чтобы убедиться, что, например, не перепутала пробирки. Сесилия проявила пленку в воскресенье, и действительно, при высокой концентрации соли РНК-компоненты фермента и у кишечной палочки, и у сенной снова проявляли активность, а их белковые компоненты не работали без РНК. Вот вам и «все ферменты – белки»! В то воскресенье Сид был у себя в кабинете, так что Сесилия смогла показать ему свои потрясающие результаты и поделиться восторгом от сделанного открытия.
Когда Сид пришел в лабораторию утром в понедельник, у него уже был написан черновик научной статьи, сообщающей об эксперименте. Они позвонили в лабораторию Нормана, чтобы поделиться результатом с коллегами. Норман был удивлен не меньше, в его картине мира так же прочно укоренилась аксиома «Все ферменты – белки»[90].
Открытие рибозимной природы РНКазы P, произошедшее через год после нашей статьи о РНК, способной к самостоятельному сплайсингу, внесло важное дополнение в концепцию рибозимов. В наших экспериментах мы обнаружили, что РНК может самостоятельно проводить собственный сплайсинг, то есть что она служит собственным внутренним катализатором. А группа Сида обнаружила, что РНК может служить и внешним катализатором, воздействуя на другую молекулу – предшественник тРНК. В обоих случаях РНК была активным двигателем клеточных реакций, а не молекулой, которая просто переносит информацию от ДНК. Именно поэтому всего через шесть лет, а именно в 1989 г., наши с Сидом взаимодополняющие исследования были удостоены Нобелевской премии по химии.
Наука работает загадочным образом. Вы предлагаете свои гипотезы, собираете доказательства, проводите эксперимент, проверяете полученные данные. Если вам повезет, то вы совершите открытие, которое ваши коллеги посчитают значимым вкладом в науку. Но вы не можете предсказать, что случится дальше, кто подхватит эстафету и куда все это будет развиваться. В случае с рибозимами новая каталитическая РНК была открыта в Австралии, скрытая в растительном патогене под названием «вироид солнечной пятнистости авокадо». Эти «молотоголовые»[91] рибозимы не забивали гвоздей, а катализировали очень простую реакцию: они разрезали себя или другие молекулы РНК в определенном месте. Из-за малого размера – около 30 нуклеотидов – они привлекли к себе много внимания[92]. Итак, РНК не обязательно должна быть огромной, чтобы действовать как фермент.
Вскоре ученые выяснили, что каталитическая сила РНК прячется и в мяРНК, отвечающих за сплайсинг. Оказалось, что природа прибегает к помощи мяРНК не только для такой важной задачи, как маркировка участков, где должен пройти сплайсинг. Кроме того, несколько мяРНК совместно катализируют реакции разрезания и соединения, составляющие сплайсинг. Многие исследователи, изучавшие разные биологические системы, внесли свой вклад в открытие этих функций мяРНК. Среди таких ученых была Кристин Гатри из Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе.
Кристин использовала в качестве исследуемой системы дрожжи, с помощью которых мы варим пиво. Поначалу это удивило многих ученых, занимающихся РНК. Однако дрожжи прекрасно подходят для генетических исследований: можно вызвать мутацию в определенном гене и посмотреть, что получится в результате, поэтому предполагалось, что эти исследования дадут представление о фундаментальных механизмах сплайсинга. По крайней мере, так думала Кристин в 1980 г. Она часто восхваляла «великолепную мощь генетики дрожжей». Если бы она смогла найти мяРНК дрожжей, соответствующие найденным у млекопитающих U1, U2, U4, U5 и U6 мяРНК и необходимые, как тогда считалось, для проведения сплайсинга мРНК, то, внося небольшие изменения в их последовательность, можно было бы изучить, связываются ли они с другими мяРНК или с мРНК. В случае удачи Кристин помогла бы раскрыть механизмы разрезания и соединения, благодаря которым происходит сплайсинг мРНК.
Хорошо, что у Кристин была столь сильная тяга к исследованиям, хотя она практически не получала никакой поддержки. Ее руководитель в аспирантуре прямо говорил: «Девушкам нечего делать в биохимии. Они не могут поднимать тяжелые роторы [часть центрифуги, которая удерживает пробирки] или проводить многие часы в холодной комнате [холодильное помещение, где проводят биохимическую очистку]»[93]. В то время как Кристин долгое время пыталась найти мяРНК дрожжей, что вполне очевидно, так как нельзя вызвать нужную мутацию, не зная, в каком гене она должна быть, многие ее коллеги, изучавшие РНК, отзывались о ее работе с пренебрежением. Они постоянно напоминали, что в дрожжах интроны есть лишь у крайне ограниченного количества генов, поэтому у них может быть уникальный механизм сплайсинга мРНК, не родственный тому, что мы наблюдаем у человека[94]. Если оглянуться назад, покажется странным, насколько некоторые биологи, погруженные в изучение эволюции, могли сомневаться в наличии фундаментальных механизмов сплайсинга, консервативных для всех тех видов, у которых есть интроны. Однако сложность обнаружения мяРНК у дрожжей подпитывала подобный скепсис. Может быть, у дрожжей и вовсе нет мяРНК?
Кристин и сотрудники ее лаборатории потратили пять долгих лет на тщательное изучение дрожжевых клеток, прежде чем нашли первую мяРНК под названием U5. С помощью ряда способов, применяемых генетиками при работе с дрожжами, удалось показать, что клетки, лишенные этой РНК, перестают расти и накапливают не прошедшие сплайсинг РНК. Это означало, что U5 дрожжей должна быть вовлечена в процесс сплайсинга[95]. К поиску присоединились новые группы исследователей, и вскоре были найдены и другие мяРНК[96], отвечающие за разные этапы реакции сплайсинга.
Теперь Кристин знала разных участников процесса сплайсинга, но оказалось, что они способны собираться вместе разными путями и что их положение может меняться в ходе реакции. Такую проблему не получится решить одним махом.
К 1986 г. был достигнут некоторый прогресс. Исследователи выяснили, что U1 связывается с левым концом каждого интрона, как изначально и предполагали Лернер и Стейц, но затем она уходит со сцены[97]. Рой Паркер, студент из лаборатории Кристин, показал, что рядом с правым концом каждого интрона прикрепляется U2[98]. Однако что происходило дальше, оставалось загадкой.
В то время я был в числе исследователей РНК, которые ежегодно собирались в Скалистых горах на лыжно-кулинарное мероприятие, прозванное Томом Стейцем «РибоСки». После дня, проведенного на склонах, Кристин, Джоан Стейц и Джон Абельсон часами обсуждали данные по сплайсингу, а я, Элсбет Лунд и Джим Дальберг из Висконсинского университета и Олке Уленбеком из Боулдера следили за их дискуссией. Всех нас интересовало, как мяРНК могут располагаться относительно друг друга на разных этапах реакции сплайсинга. Я уверен, что в такой дружеской атмосфере родилось немало хороших идей, но Кристин потребовалось еще несколько лет упорной работы, чтобы составить схему каждого этапа сплайсинга.
Прорыв случился в один из вечеров 1992 г. Кристин работала допоздна в своей лаборатории в Сан-Франциско, размышляя над новыми результатами, полученными вместе со студентом Хитеном Мадхани и касающимися мяРНК под названием U6[99]. На этот раз она нашла ключ к разгадке. Когда она набросала схему решения для механизма сплайсинга, то картина оказалась похожа не на обычную биохимическую реакцию, а на целое балетное представление. U6 выходит на сцену, тесно переплетаясь с U4, и вместе они находят свое место в интроне. Но тут в дело вмешивается U2, уводя U6, и U4 в ярости ретируется. После этого U6 и U2, отчасти при помощи U5, могут свободно выполнять химические реакции, необходимые для завершения сплайсинга. Вместе они действуют как рибозим, катализируя процесс сплайсинга мРНК.
Кристин была настолько потрясена обнаруженным феноменом, что просто обязана была кому-то об этом рассказать. Но в здании было почти темно. Выйдя в коридор, она встретила уборщика, который подметал пол, и поделилась с ним своим открытием.
«И он даже что-то понял!»[100]
Почему так много ученых, в том числе поначалу даже в моей лаборатории, или в лаборатории Сида Альтмана, или Нормана Пейса, не воспринимали всерьез предположение, что РНК может быть ферментом? Почему мы были так прочно привязаны к мысли, что в основе катализатора должен лежать именно белок? Отчасти потому, что мы знали, как белок сворачивается в сложные формы, предназначенные для выполнения конкретных и специальных задач. Разрушение этой структуры, например при нагревании белка или вследствие генетической мутации, ведет к потере такой активности.
И, напротив, о структуре РНК мы в то время знали недостаточно, чтобы понять, как она может быть катализатором. В частности, мРНК всегда изображают как отваренные спагетти: то есть неспособными принять какую-либо стабильную форму. Даже если спагетти в вашей тарелке и скручиваются, они сразу выпрямляются, когда вы цепляете их вилкой.
При работе с РНК мы думали о ней, так сказать, лишь в двух измерениях. Мы рассматривали линейный порядок оснований А, Г, Ц и У, подобно буквам в предложении, а также соединение оснований внутри этих последовательностей, как в структуре U1 мяРНК, описанной выше. Но чтобы понять, как РНК может быть ферментом, надо увидеть молекулу во всех трех измерениях. Вспомните, как мало мы понимали про молекулярные механизмы генетики, пока не увидели трехмерную форму двойной спирали ДНК. Точно так же мы не имели возможности понять каталитические молекулы РНК, пока не разобрались с их структурой.