В архитектуре есть знаменитый принцип: «Форма следует за функцией»[101], и это утверждение верно для многого другого в физическом мире. У молотка и отвертки разная форма, каждая соответствует своему назначению, но у них схожие рукоятки, потому что функция этой части одинакова – лежать в руке человека. Тот же принцип применим и на клеточном уровне. Если фермент расщепляет пищу на мелкие фрагменты, которые далее могут быть использованы в метаболизме, то у него будет углубление для размещения молекулы, например, крахмала, которую необходимо разрушить. Если функция белка – сокращение мышц, то у него должна быть подвижная область, которая будет обеспечивать растяжение и сокращение.
Взаимосвязь формы и функции означает, что мы не можем понять значение молекул жизни до тех пор, пока не узнаем их структуру, не выясним, из чего они сделаны и как соединяются друг с другом. Без знания структуры биологи похожи на механиков, пытающихся отремонтировать автомобильный двигатель в полной темноте. Это будет медленно, неэффективно и закончится разочарованием. Знание структуры подобно включению света. Теперь механики видят все детали двигателя, представляют, как они сочетаются друг с другом, какие части или соединения сломаны и как их можно починить. Первое поколение молекулярных биологов считало расшифровку физической структуры белков, а затем и ДНК важными и благородными задачами. Для этого применяли рентгеноструктурную кристаллографию. При использовании этого метода на образец, например на кристалл белка, направляют пучок рентгеновских лучей, получают изображение рассеянного излучения и рассчитывают, какая структура могла вызвать такое рассеивание. Представим себе камешек, брошенный в тихий пруд. От него идут круги, по которым можно определить место, где именно камешек попал в воду. Теперь представим, что в пруд бросили горсть камней. Картина получилась более сложной, но в ней содержится информация о месте падения каждого камешка. Точно так же картина рассеивания, созданная рентгеновским лучом, прошедшим через кристалл, помогает определить положение каждого отдельного атома белка.
А как насчет РНК? Мы уже знаем, что у РНК есть удивительные функции, и еще познакомимся со многими другими. Для каждой из этих функций должны существовать соответствующая форма и особая структура, обеспечивающие выполнение конкретной функции. Однако определить форму для РНК оказалось гораздо сложнее, чем для ДНК.
Джим Уотсон понял это далеко не сразу. После открытия двойной спирали он подумал, что на бис сможет разгадать и структуру РНК[102]. Но столкнулся с проблемой. У ДНК была только одна форма – двойная спираль, где две нити соединены друг с другом. Такая витая конструкция фиксирует обе нити и держит их под контролем, или, как мы, исследователи РНК, шутим, удерживает их от чего-нибудь интересного, например от катализа реакций. У РНК, напротив, нет одной-единственной формы, у нее миллионы возможных форм. Лишенная ограничений двойной спирали, РНК может принимать практически неограниченное количество форм, поэтому она потрясающе универсальна. При такой вариативности РНК еще важнее разобраться в многообразии ее перевоплощений. Однако определение структуры столь изворотливого вещества было сопряжено с немалыми трудностями.
Уотсон бился над проблемой РНК с десяток лет. Вначале он выделял РНК, в том числе из растительных вирусов, дрожжей и печени теленка, проводил эксперименты с дифракцией рентгеновских лучей и на основании весьма неточных данных пришел к выводу, что у разных РНК единая структура[103]. Это примерно как в густом тумане посмотреть на слона и на микроавтобус Volkswagen с расстояния 200 м и прийти к выводу, что они схожи по строению. Если бы у вас был бинокль и вы дождались ясной погоды, то ваш вывод был бы совершенно иным.
Прежде чем сдаться, Уотсон сделал шаг в верном направлении. Он перешел от изучения богатого набора разнообразных РНК с множеством функций и, соответственно, с множеством форм к работе с очищенными рибосомами[104], у РНК которых специфическая структура, подходящая для выполнения специфической функции – синтеза белка. Однако на разработку технологий и приемов, нужных для разгадки структуры рибосомы, науке потребовалось еще 40 лет.
И когда наконец перед нами предстали сложные структуры РНК, мы смогли непосредственно увидеть, как она творит свои чудеса, как служит машиной для сборки необходимых белковых молекул, достраивает концы хромосом или очень точно редактирует ДНК в клетках человека. Но все эти открытия каталитической силы РНК были в будущем. Успех начинался с малого.
Боб Холли из Корнеллского университета продолжил дело Джима Уотсона. В конце 1950-х гг. он понял, что глупо пытаться угадать единую структуру в смеси разных РНК, поэтому сосредоточился на транспортной РНК – адаптере, который соединяет аминокислоту и триплетный кодон. Транспортная РНК была небольшого размера, достаточного, чтобы у экспериментатора был шанс определить последовательность ее нуклеотидов, что в то время еще не было сделано ни для одного типа РНК[105].
Зачем Холли нужно было узнать последовательность РНК, прежде чем он или кто-либо еще попытается определить ее форму? Определение структуры РНК сродни составлению схемы предложения. Даже если вы величайший в мире специалист по грамматике, вы не составите схему предложения, пока не сможете прочитать его. Последовательность нуклеотидов дает вам последовательность букв в вашем предложении – азотистых оснований А, У, Ц и Г. Как только вы увидите их порядок, вы сможете приступить к составлению схемы предложения, определяя, как элементы расположены в пространстве и как они взаимодействуют друг с другом.
В качестве источника тРНК Холли выбрал всё те же дрожжи – организмы, которые мы используем в хлебопечении и пивоварении. Он знал, что в клетках дрожжей содержится много тРНК, и мог купить в местной пекарне столько дрожжей, сколько нужно. Впрочем, чтобы за три года работы получить в общей сложности 1 грамм (масса одной изюминки) тРНК определенного вида, Холли понадобилось примерно 140 килограммов дрожжей[106].
Холли удалось очистить тРНК, которая была адаптером для аминокислоты аланина[107]. Как только он и его команда получили очищенную тРНК, ее начали резать на фрагменты, достаточно короткие для химического анализа, а затем определять порядок этих фрагментов. Уже через год у них была расшифрованная последовательность нуклеотидов, что позволило впервые определить структуру РНК.
В 1965 г. Элизабет Келлер, опытная исследовательница из группы Боба Холли, взялась выяснить, как тРНК, переносящая аланин, складывается в двух измерениях. Последовательность оснований была известна, но предстояло понять, как они могут взаимодействовать между собой.
Вспомните, что РНК обычно состоит из одной нити. В ДНК основания одной нити попарно соединяются с основаниями другой нити, образуя ступеньки ДНК-лестницы и двойную спираль независимо от последовательности нуклеотидов. Но в РНК последовательность определяет форму: основания из одного участка молекулы могут находить себе пару совсем в другом участке. Связь одной пары Ц-Г слишком слабая, чтобы удерживать части вместе, тем не менее если, например, у вас четыре последовательно расположенных Г, которые связываются с четырьмя Ц, то такая структура из четырех пар оснований уже держится стабильно. Это спаривание оснований, зависящее от последовательности РНК, заставляет молекулу сворачиваться, формируя «шпильки», ветви, петли, узлы и множество других возможных фигур. Келлер быстро обнаружила, что в сворачивании тРНК могут участвовать разные комбинации пар оснований. Какая из них правильная?
Одна из подсказок заключалась в трех основаниях тРНК, которые связываются с кодоном мРНК. Поскольку они комплементарны кодону, этот триплет получил название «антикодон». Келлер и Холли сочли логичным предположение, что антикодон должен не прятаться где-то внутри складок молекулы, а торчать наружу, чтобы легко связываться с мРНК[108].
Моделируя разные варианты спариваний оснований, Келлер использовала ершики для чистки курительных трубок и кусочки застежки-липучки. В итоге она описала характерную форму трилистника, которая наиболее соответствовала ожиданиям: на вершине центрального листочка структуры располагался непарный антикодон, готовый соединиться с соответствующим кодоном мРНК.
В одноцепочечной РНК пары оснований могут образовывать внутри молекулы разные фигуры, например изображенную на рисунке «шпильку», или «стебель-петлю». Внизу слева показано, какие основания соединяются, а внизу справа изображена трехмерная форма этой «шпильки»
Вскоре были определены последовательности десятка других тРНК[109], и каждая из них теоретически могла принимать форму клеверного листа. С учетом того, что всем тРНК необходимо помещаться в одних и тех же участках в рибосоме, чтобы доставлять аминокислоты А к месту синтеза белка, ясно, что такие курьеры должны иметь одинаковую форму. Поскольку была найдена «форма, подходящая всем», это подтверждало, что структура в виде клеверного листа определена верно.
Это, несомненно, был значительный прорыв, хотя в модели клеверного листа Келлер имелось одно существенное упрощение. Она лежала на плоском столе, изображая двухмерную тРНК. Я иногда называю такие двухмерные схемы «раздавленными на дороге», потому что они показывают, как выглядела бы РНК, если бы ее переехал грузовик. Судить о поведении РНК по ее двухмерной модели так же сложно, как судить о поведении белки по ее расплющенному тельцу.
За счет соединения оснований тРНК принимает форму клеверного листа (слева), который потом сворачивается в трехмерную L-образную структуру (справа). Триплетный антикодон доступен, что позволяет ему образовывать связи с кодоном РНК мРНК и доставлять правильную аминокислоту (Ак) в рибосому
В конце 1960-х гг. развернулась гонка за определение трехмерной структуры тРНК. Соревновались Кембридж против Кембриджа: одну команду возглавляли Ким Сон Хоу и Алекс Рич из Массачусетского технологического института, другую – Аарон Клуг и Дж. Д. Робертус из лаборатории молекулярной биологии в другом Кембридже[110].
Они выбрали метод рентгеноструктурной кристаллографии, с помощью которого в то время повсеместно определяли структуру белков. Для выращивания кристаллов в лаборатории готовят сильно концентрированный раствор очищенных молекул, а затем их размещают в ряде капель с различными концентрациями добавок, например солей. Надо найти золотую середину, когда образуются подходящие кристаллы. Если молекулы слишком хорошо растворяются в капле, раствор останется прозрачным и в нем не будет никаких кристаллов. Если же молекулы окажутся нерастворимыми, то они выпадут в виде бесполезного мутного осадка. В какой-то капле возникнут условия, при которых ваше вещество будет балансировать на грани растворимой и нерастворимой формы, и тогда его молекулы начнут прижиматься друг к другу, образуя правильные ряды и столбцы. Наблюдая за ними в микроскоп, вы увидите красивые кристаллы с острыми гранями. Эти кристаллы будут медленно расти и с каждым днем становиться все крупнее. Затем один такой кристалл размещают напротив пучка рентгеновских лучей, включают излучение и собирают изображения, рассеянные кристаллами. После нескольких дополнительных действий и множества расчетов структура может быть «вычислена», то есть вы получите трехмерную модель, где указан каждый атом.
Кристаллизация наполовину наука, наполовину искусство, поэтому ученые понимали, что работать надо с тем, с чем получается. Среди тРНК проще всего образовывались кристаллы той, что переносит фенилаланин, вот почему именно ее структуру расшифровали и та и другая команда-конкурент. Оказалось, что форма листа клевера, предсказанная Элизабет Келлер, была верной и этот листок сам собой сворачивался в молекулу L-образной формы[111]. На одном конце L был антикодоновый триплет, а на другом крепилась соответствующая ему аминокислота фенилаланин.
Итак, в 1974 г. впервые была определена трехмерная структура РНК с известной биологической функцией, и это стало потрясающим достижением команд из обоих Кембриджей. В подобных случаях за первым открытием обычно идут быстрой чередой множество других. Это как первая упавшая косточка домино, которая вызывает каскад падений. Но такой эффект не соответствовал истории РНК. За 15 лет после открытия структуры тРНК фенилаланина ни для каких других молекул РНК, более длинных, чем тРНК, структура не была расшифрована. Несмотря на огромные усилия бесчисленного множества ученых, другие известные типы РНК оказались слишком изворотливыми, так что их структуру зафиксировать не удавалось. А в отсутствие структуры, на которую можно было бы ориентироваться, изучение роли отдельных нуклеотидов в крупных молекулах РНК, таких как рибозим тетрахимены, происходило крайне медленно и с большим трудом.
Пока все ожидали появления технологии, позволяющей хорошо кристаллизовать более сложные по типу РНК, Франсуа Мишель размышлял. Франсуа был сотрудником Национального центра научных исследований (НЦНИ) в городе Жиф-сюр-Иветт недалеко от Парижа. Он увлекался коллекционированием, разведением и выяснением генетических особенностей разных видов бабочек и с такой же страстью собирал последовательности РНК. У него была на них поразительная память. Говорят, что он мог сравнивать в уме молекулы и пытался их соединить друг с другом разными способами, даже когда спал. Он был похож на эксцентричного гения – пышная шевелюра, большая борода. Когда я встречал его на конференциях, мне иногда казалось, что он только что вышел из леса после многомесячной охоты за бабочками.
Коллеги Франсуа из Жифа обнаружили в ДНК дрожжевых митохондрий – структурах, выполняющих роль энергетических станций клеток, – новую группу интронов с удивительными генетическими свойствами. По девяти различным интронам были разбросаны маленькие и практически идентичные фрагменты. Причем эти фрагменты располагались в одном и том же порядке, что указывало на выполнение ими схожих функций. Франсуа знал, что эти короткие последовательности нуклеотидов жизненно необходимы для сплайсинга, потому что если в них случались мутации, то сплайсинг не происходил. Более того, пары этих фрагментов были комплементарны друг другу, и логично было сделать вывод, что они могут сцепляться друг с другом, образуя «шпильку» (см. рисунок выше). В 1982 г. Франсуа предположил, что эти парные участки РНК способны образовывать схожие двухмерные структуры для всех таких митохондриальных интронов у дрожжей[112].
Но зачем интронам нужна какая-то особая форма? Ведь если они похожи на интроны мРНК, открытые Филом Шарпом и Ричардом Робертсом, то им не надо обладать определенной структурой, чтобы они могли связываться с мяРНК U1 и U2. Загадка структуры интронов продержалась недолго, потому что вскоре после того, как Франсуа предложил свою модель, мы опубликовали нашу статью об открытии рибозима у тетрахимены. Франсуа потребовалось несколько секунд, чтобы посмотреть на последовательность нуклеотидов в интроне тетрахимены и понять, что его двухмерная модель подходит и для нашего самовырезающегося интрона[113]. Это было удивительно и неожиданно. Дрожжи эволюционно очень далеки от инфузорий, к которым относится тетрахимена, а митохондриальные гены совсем не похожи на ядерные. Так почему же неродственные во всех отношениях РНК принимали сходную форму? Ответ был шокирующим. Такая форма должна была быть необходимой для катализа реакции самостоятельного сплайсинга, а это значит, что и митохондриальные интроны у дрожжей должны быть способны к самостоятельному сплайсингу. И действительно, в 1985 г. группа голландских ученых подтвердила это предположение[114].
Двухмерная модель Франсуа выглядела как расширенная версия клеверного листа тРНК. Интроны РНК были в несколько раз длиннее, чем тРНК, а их структура была более сложной. Вместо четырех «шпилек», имевшихся в тРНК, там присутствовало более десятка подобных форм. Появление такого подробного плана молекулы было заметным достижением, но Франсуа понимал, что каталитическая функция РНК реализуется не в двухмерном пространстве. Он стремился построить трехмерную модель, основываясь только на последовательности нуклеотидов, чего еще никто не делал для таких больших РНК.
В 1983 г. на научной конференции Франсуа познакомился с Эриком Вестхофом из Страсбургского университета. Эрик провел детство в Бельгийском Конго, получил диплом физика в Льежском университете и затем изучал структуру тРНК с помощью рентгеноструктурной кристаллографии в Висконсинском университете. Со своим образованием и навыками он прекрасно дополнял Франсуа, и оба страстно мечтали получить из двухмерной модели РНК трехмерную. Страсбург расположен в богатой виноградниками долине Рейна, а это не очень близко от Парижа, так что Франсуа, приезжая к Эрику для обсуждения модели, брал с собой спальный мешок. Эрик сидел за компьютером, строя спирали РНК, соответствующие парным участкам в структуре интрона тетрахимены. Это было несложно: участки двойной спирали РНК похожи на маленькие фрагменты двойной спирали ДНК, а углы наклона спирали соответствовали тому, что можно было видеть у кристаллической структуры тРНК. Значительно сложнее было выяснить, как надо расположить эти маленькие спирали в трехмерном пространстве, чтобы получить структуру фермента. Оставалось надеяться, что их трехмерное расположение удастся понять по участкам РНК, соединяющим спирали, ведь именно такие промежуточные последовательности обеспечивают сворачивание клеверного листа тРНК в L-образную трехмерную форму.
Франсуа сидел рядом с Эриком и просматривал распечатки 87 последовательностей сходных интронов, способных к самосплайсингу. Помимо распечатанных последовательностей, множество других Франсуа держал в уме. Когда Эрик на своем экране перемещал участки РНК, образуя новые фигуры, Франсуа искал любые согласованные изменения в последовательностях различных интронов, которые указывали бы на то, что определенные нуклеотиды граничат друг с другом в трехмерном пространстве. Как только Франсуа находил такие участки, раздавалось его восклицание: «Вот оно!» По ночам он сворачивался калачиком в спальном мешке рядом с компьютером Эрика, а видения последовательностей РНК кружились в его голове, как бабочки в танце[115].
К 1990 г. Франсуа и Эрик создали свою трехмерную модель интрона тетрахимены[116], и, с точки зрения специалистов по РНК, она была потрясающе красива. Она (модель) больше всего напоминали родителей, обнимающих своего ребенка. «Ребенком» были двуцепочечные участки РНК в местах, где должно произойти разрезание и последующее соединение. Одним из «родителей» был участок РНК, который, как ранее показал Франсуа, содержал гаунозин. Он выступал в роли ножниц, которые «вырезали» интрон[117]. Другим «родителем» служил P4–P6 (спаренные области 4–6), помогая правильно расположить эти ключевые элементы РНК.
В такую модель все идеально укладывалось, но насколько она соответствовала реальной структуре? Чтобы это выяснить, потребовалась рентгеноструктурная кристаллография, а также талант и сила духа молодой женщины с Гавайев.
Трехмерная структура РНК тетрахимены, способной к самосплайсингу, смоделированная Франсуа Мишелем и Эриком Вестхофом. Интрон (светло-серый) соединен с РНК рядом с сайтом сплайсинга (темно-серый). Интрон также связан с молекулой гуанозина (Г). Гуанозин сам по себе является одним из структурных элементов РНК. Здесь он используется как химические ножницы, разрезающие РНК, отмеченную темным цветом, в месте сплайсинга
Дженнифер Даудна выросла на зеленом восточном побережье Большого острова Гавайев. С ранних лет она увлекалась наукой, исследуя чудеса местных литоральных водоемов и с трепетом поднимаясь на край действующего вулкана Килауэа[118]. Ради продолжения учебы она пересекла Тихий океан, поступила на специальность «биохимия» в Помонский колледж в Калифорнии, а затем двинулась дальше и стала аспиранткой Гарвардской медицинской школы. Там она защитила диссертацию по функциям рибозима тетрахимены.
Таким образом, мы с ней оказались в некоторой степени конкурентами, хотя наше соперничество было исключительно дружеским. Когда в период своей аспирантуры Дженнифер приехала ко мне в Боулдер, эта хрупкая женщина произвела на меня большое впечатление и, возможно, даже немного меня напугала. Она могла великолепно спланировать эксперимент для проверки любой гипотезы и обладала такой энергией и драйвом, каких я не встречал больше ни у одного ученого. Поэтому, когда в 1989 г. она защитила диссертацию и попросилась к нам в постдокторантуру, я сразу же согласился.
Мы с Дженнифер, как и многие другие специалисты по РНК, были убеждены, что для понимания механизмов работы всякого рибозима необходимо получить трехмерное изображение его формы. Но в исследованиях РНК наблюдался застой: с тех пор как полтора десятилетия назад была описана форма транспортной РНК, структуры каких-либо более крупных РНК открыты не были. Мы понимали, что получение такого изображения было очень перспективной задачей. И если бы нам удалось решить ее, это стало бы достижением, которое вошло бы в учебники по всему миру.
Разгадав структуру рибозима, мы бы открыли поистине золотую жилу для получения ответов на более общие вопросы о структуре РНК, в том числе помогли бы разгадать пресловутую головоломку, каким образом РНК сворачивается, принимая специфическую для катализатора форму. Способы сворачивания белков и формирования каталитически активных центров были хорошо известны. Белковый фермент убирает все свои гидрофобные (боящиеся воды) боковые цепочки внутрь, образуя гидрофобное ядро. Это позволяет сформировать каталитически активную бороздку на внешней гидрофильной (любящей воду) поверхности. Но РНК не может сворачиваться таким же образом, поскольку у нее нет никаких гидрофобных участков, которые можно было бы для этого использовать. Более того, РНК на всем своем протяжении заряжена отрицательно, тогда как боковые цепи белка, как правило, не имеют заряда[119]. Чтобы РНК образовала компактную структуру, все эти отрицательные заряды должны оказаться рядом друг с другом. Это все равно что расположить магниты южными полюсами внутрь и попытаться их сблизить – они будут отталкиваться. Форма тРНК была лишь одним примером возможной структуры РНК, и она не была катализатором. Сама по себе тРНК ничего не делает без рибосом и мРНК. Структура рибозима тетрахимены дала бы первые представления о том, как крупная молекула РНК может складываться наподобие белка, хотя кажется, что она для такого действия не приспособлена.
Когда в 1991 г. Дженнифер приехала к нам в Боулдер, мы с ней решили, что было бы слишком самонадеянно пытаться сразу определить структуру рибозима тетрахимены, который состоял из 414 нуклеотидов, то есть был примерно в шесть раз длиннее тРНК. Вместо этого мы выбрали в качестве первой цели для кристаллографии половину этой молекулы. Причем половину с такой структурой и функцией, что она была достойна усилий. Аспирантка из моей лаборатории Фелисия Мерфи выделила подходящий нам ключевой компонент рибозима – P4–P6[120]. Фелисия обнаружила, что он сам складывается поперек, напоминая старомодную бельевую прищепку, и что он важен для правильной ориентации нити РНК, содержащей один или два сайта сплайсинга, хотя на уровне отдельных атомов детали были еще неизвестны. Дженнифер предстояло их выяснить.
Дженнифер объединилась с научным сотрудником нашей лаборатории Анной Гудинг, и вместе они синтезировали участок РНК P4–P6 и приготовили набор капель с разными солевыми условиями для кристаллизации. Вскоре был найден вариант, при котором образовывались красивые кристаллы с острыми гранями. Предположительно, молекулы РНК были выстроены в этих кристаллах идеальными рядами и колоннами, однако поначалу рентгеновский луч не давал хорошей дифракционной картины. Само излучение повреждало РНК в кристалле, мешая получить четкое изображение.
В 1993 г. в Боулдере проводили свой творческий отпуск два профессора из Йельского университета, а именно супруги Стейц, Джоан и Том, постоянные участники РибоСки. Они встретились с нашей научной группой и с группой моего коллеги Олке Уленбека. Том Стейц был одним из крупнейших в мире специалистов по рентгеноструктурной кристаллографии, и его команда в Йельском университете определила устройство некоторых важных структур, в том числе ключевых комплексов ДНК и РНК с белками. Том любил поговорить на профессиональные темы в нашей комнате отдыха и однажды в беседе с Дженнифер упомянул, как его группа начала замораживать кристаллы, чтобы свести к минимуму повреждения от радиоактивного излучения. Они использовали жидкий азот, чтобы сохранить пропанол очень холодным, а затем быстро погружали в пропанол кристалл – так, чтобы не успел образоваться лед. Дженнифер и Анна применили этот метод и с радостью обнаружили, что дифракционная картина участка P4–P6 заметно улучшилась. Этого оказалось достаточно, чтобы можно было увидеть, как расположены отдельные атомы в свернутой структуре РНК.
Однако, как правило, научный прогресс – это два шага вперед и шаг назад, и так бывает еще в удачную неделю. Нашим большим «шагом назад» была техническая проблема[121], которая постоянно беспокоила нас с Дженнифер во время ее работы в Боулдере. Для определения структуры нужны кристаллы не только самой молекулы, но и ее тяжелоатомного производного, где в одной или в нескольких фиксированных позициях в молекуле находится тяжелый атом.
Под тяжелым атомом подразумевается элемент, у которого много протонов, нейтронов и электронов, например платина, золото, серебро, ртуть, селен, вольфрам или осмий. Только сравнивая дифракционную картину обычного вещества и его тяжелоатомного производного, можно рассчитать трехмерную структуру молекулы. Тяжелые атомы, которые могли угнездиться в выемках белковых молекул, были хорошо известны, но РНК – это совсем другое. Те тяжелые атомы, которые использовались с белками, просто не подходили для РНК.
Итак, на тот момент структура P4–P6 оставалась неразгаданной. Однако после трех лет работы у Дженнифер благодаря ее диссертации в Гарварде и успешным новаторским исследованиям структуры РНК в Боулдере была такая блестящая репутация, что университеты боролись за право пригласить ее на работу. Она выбрала Йельский университет – во многом потому, что у нее уже были хорошие отношения с Томом и Джоан Стейц. И захватила с собой аспиранта из Боулдера Джейми Кейта, который продолжал проверять металл за металлом, надеясь получить тяжелоатомное производное. После того как многие металлы не подошли для этой задачи, Джейми заметил, что ион осмия по размеру как раз такой, что его можно использовать для замещения иона магния в свернутой РНК. Подходящее соединение осмия было синтезировано химиком из Стэнфордского университета, который вот-вот уходил на пенсию. По счастливой случайности Джейми связался с ним перед самой ликвидацией его лаборатории и получил в подарок то, что оказалось волшебным металлом. Это соединение осмия действительно заменило три атома магния, связанные с определенными участками РНК[122], что в 1996 г. привело наконец Дженнифер и Джейми к разгадке структуры P4–P6 РНК.
Картина открылась великолепная. Стало понятно, как молекула может складываться, подобно белкам, образуя компактное внутреннее ядро, что казалось столь сложным для РНК. Впрочем, для РНК-катализатора это было логично – сворачиваться как белок. Ведь если РНК ведет себя как белок, то почему бы ей и не выглядеть как белок? Оказалось также, что внутри у нее располагаются положительно заряженные ионы магния, которые обычно входят в состав живых клеток, и это решает проблему отталкивания отрицательно заряженных участков РНК при ее сворачивании. Давайте еще раз вспомним магниты: если вы захотите сблизить два отрицательно заряженных полюса так, чтобы они оставались рядом друг с другом, то разместите положительный полюс между ними.
Дальше надо было определить структуру целого рибозима. Барбара Голден приехала в Боулдер проходить постдокторантуру, и в 1998 г. она установила новый рекорд в РНК-кристаллографии, исследуя участок интрона тетрахимены длиной в 247 нуклеотидов, у которого была каталитическая активность[123]. В эту РНК входил и домен P4–P6, который, как мы и предсказывали, в составе активного рибозима P4–P6 выглядел почти так же, как и сам по себе. Кроме того, у интрона Барбары существовала «колыбель», образованная цепочкой РНК, которая должна была охватить спираль РНК в месте проведения сплайсинга. Это было вполне похоже на модель, которую предложили Мишель и Вестхоф восемью годами раньше.
Открытие структуры домена P4–P6 тетрахимены послужило стимулом к развитию небольшой научной области, занимающейся структурой РНК, и вскоре было описано строение других крупных функциональных молекул РНК[124]. В совокупности эти результаты позволяли хотя бы предварительно оценить многочисленные возможности РНК. У каждой ее разновидности, безусловно, была своя форма, но общие принципы, которые мы отметили у тетрахимены, вероятно, вновь повторялись во многих других РНК. Это прекрасно демонстрировало, насколько сложны могут быть молекулярные машины, составленные только из А, Г, Ц и У.
Следующее десятилетие изучение структуры РНК продолжалось примерно теми же темпами. Каждый год специалисты описывали еще одну или две новые конфигурации. Исследователи постепенно продвигались вперед; однако, в то время как были разгаданы уже десятки тысяч белковых структур, у РНК доля известных структур составляла менее одного процента[125]. Ситуация не могла не огорчать, поскольку тормозилось выявление фундаментальных основ устройства РНК и развитие жизненно важных по своему потенциалу медицинских технологий. Ученым, разрабатывающим препараты для борьбы с заболеваниями, необходимо подробно знать строение своих молекул-мишеней, чтобы не действовать вслепую. Если мишень – белок, то ее структура обычно уже бывает кем-то определена или же ее можно рассчитать на основе обширных баз близкородственных веществ. Но структуры многих РНК оставались неизвестны, что сдерживало разработку препаратов. Для эффективного определения структуры молекул РНК нужен был новый подход.
Кроме медленной и неточной рентгеноструктурной кристаллографии, есть и другие способы предсказать форму молекулы РНК. Один из методов мы знаем: надо найти по-настоящему умных людей, хорошо понимающих принципы сворачивания РНК, таких как Франсуа Мишель и Эрик Вестхоф, и дать им несколько лет на решение проблемы. Но можно подойти и с другой стороны: взять тысячи обычных людей, незнакомых со структурой РНК, и позволить им в течение нескольких часов попытать силы в решении задачи. Все мы слышали про краудсорсинг. Может ли он сработать в отношении такой непростой темы, как сворачивание РНК? И скольких людей можно этим заинтересовать?
В один январский день 2017 г. я сидел в кабинете Риджу Даса в Стэнфордском университете с открытым от изумления ртом. Всегда интересно послушать рассказ коллеги о том, как он сделал что-то фантастическое, о чем ты даже помыслить не мог. Риджу тогда привлек 37 000 человек со всего мира к компьютерной игре Eterna, или EteRNA, и эти игроки искали способы сворачивания РНК[126].
В 2009 г. в игре ЕteRNA появилась первая задача – спроектировать такую РНК, которая будет сворачиваться в виде пятиконечной звезды или в виде креста. То есть надо было определить, какая последовательность А, Г, Ц и У станет образовывать правильные пары, которые сложатся в заданную форму. В игре участвовали самые разные люди. Там были как аспиранты, занимавшиеся исследованиями РНК, так и любители разгадывать судоку, которые едва ли слышали про РНК, но хотели попробовать решить новый вид головоломок. Одни игроки разработали компьютерные программы для сворачивания РНК, другие обходились карандашом и бумагой. Участники выкладывали свои решения на сайт ЕteRNA, а затем все голосовали за те последовательности, которые, по их мнению, вероятнее всего примут только нужную форму и никакую другую. Восемь последовательностей, получившие наибольшее число голосов, были синтезированы в Стэнфордском университете. Каждая из них была проверена с помощью надежного метода SHAPE, предложенного моим бывшим постдоком Кевином Уиксом, ныне работающим в Университете Северной Каролины в Чапел-Хилле. При использовании этого метода РНК обрабатывают специальными веществами, взаимодействующими только с одиночными нуклеотидами, а затем определяют прореагировавшие нуклеотиды. Например, если РНК действительно свернулась в виде звезды, то SHAPE должен выявить прореагировавшие нуклеотиды, как показано на рисунке ниже.
Победители конкурса ЕteRNA на предсказание последовательности РНК, сворачивающейся в виде креста, вытянутого креста или звезды. Чтобы проверить точность предсказания, провели химическую реакцию по методике SHAPE, которая выявила одноцепочечные участки в каждой структуре. Некоторые из них показаны стрелками
В этом испытании приняли участие 37 000 игроков, и лучшие из них нашли решения для всех задач. Результаты оказались настолько впечатляющими, что были опубликованы, причем в качестве соавторов, что еще удивительнее, указали 100 участников ЕteRNA[127]. По состоянию на 2022 год этим сообществом игроков были решены 4 181 632 задачи по определению структур РНК, причем большинство участников практически ничего не знали о РНК до того, как увлеклись игрой.
В последние годы ЕteRNA подняла ставки и занялась настоящими исследовательскими проектами. Например, в конкурсе Open Vaccine 2020 г. игроки должны были разработать улучшенную версию мРНК-вакцины против COVID–19, для хранения которой не требовались бы сверхнизкие температуры. Гипотеза (а точнее, обоснованное предположение) заключалась в том, что, если разработать мРНК, кодирующую белок шипа коронавируса, в которой будет множество спаренных оснований, такая молекула будет более стабильной при хранении и при введении в руку человека. А поскольку многие аминокислоты кодируются двумя, четырьмя и даже шестью кодонами, то количество возможных вариантов записи белка шипа было просто невероятным. Это число – 10630 – казалось бесконечным, и не существовало компьютера, способного обработать такое количество последовательностей. Поэтому ЕteRNA пригласила к решению проблемы всех желающих и стала ждать поступления ответов. Кандидатов было много, потому что этот конкурс начался 18 марта 2020 г., когда многие люди оказались из-за COVID–19 заперты в своих домах.
Игроки нашли множество вариантов «суперсвернутых» РНК, где большинство оснований были соединены попарно. Однако действительно ли эти последовательности были более стабильными? В Стэнфордском университете протестировали стабильность восьми таких «суперсвернутых» РНК при хранении и введении внутрь человеческой клетки. Ко всеобщей радости, эти последовательности действительно оказались более устойчивыми, чем те, что были разработаны современными компьютерными программами[128]. И тогда стэнфордские исследователи затаили дыхание[129]: вдруг эти молекулы РНК настолько плотно упакованы, что не смогут пройти через рибосомы и белок шипа не образуется? Беспокойство оказалось напрасным, трансляция с мРНК в белок прошла без проблем. Тогда наконец «суперсвернутую» мРНК передали в Pfizer разработчикам, которые проверили, как долго она сохраняется в форме вакцины. После хранения при умеренно высоких температурах в течение двух недель эта вакцина практически не изменилась, сохранившись намного лучше, чем вакцины, разработанные с помощью современных технологий. Существующие официально одобренные мРНК-вакцины против COVID–19 хранятся и перевозятся при сверхнизких температурах, а это затрудняет их доставку в бедные страны, поэтому повышенная термостабильность дает замечательные возможности в дальнейшем получить более доступный и дешевый препарат для прививок.
Использование коллективного разума – уникальный способ определить структуру РНК. Однако в будущем в этой области, вероятнее всего, произойдет замена человеческого разума на машинное обучение. Искусственный интеллект (ИИ) уже пишет статьи для газет и посты в социальные сети, он может превращать речь в текстовую версию, он способен, впрочем, пока только теоретически, обеспечить безопасное движение беспилотных автомобилей по городу. Так можем ли мы использовать его для предсказания структуры РНК? Мог ли он сэкономить Мишелю и Вестхофу семь лет работы, потребовавшиеся для разгадывания структуры интрона, способного к самостоятельному сплайсингу? Мог ли он сберечь семь лет работы моей лаборатории, в течение которых мы определяли структуру этого интрона с помощью рентгеноструктурной кристаллографии? Мог ли он заменить 37 000 человек, играющих в EteRNA, чтобы найти лучшие последовательности, позволяющие РНК свернуться в виде креста или звезды? Почти наверняка ответ будет «Да», и, хотя мы этого еще не достигли, будущее кажется очевидным.
В 2021 г. один из авторов игры EteRNA Риджу Дас и его коллега по Стэнфордскому университету Рон Дрор объявили о крупном достижении[130]. Им удалось разработать программу ИИ, которая может довольно точно предсказывать, какую трехмерную форму примет заданная последовательность РНК при сворачивании. Среди сложностей, с которыми они столкнулись, был подбор адекватного «набора данных для обучения». Алгоритмам ИИ необходимо обучение на некой известной информации, прежде чем погрузиться в неизвестность. ИИ без проблем отличает фотографии собак от фотографий кошек, потому что эта программа обучилась на миллионах изображений в интернете, подписанных как «Собака» или «Кошка». Но в случае РНК у Даса и Дрора в наборе для обучения имелось лишь 18 последовательностей, структура которых была известна. Более того, они просили ИИ не просто распознать увиденную форму РНК, а в соответствии с последовательностью А, Г, Ц и У предсказать правильную трехмерную структуру. Примечательно, что заданных 18 последовательностей оказалось достаточно, чтобы их программа превзошла предыдущие методы предсказания структуры РНК.
Как можно оценить успешность предсказания трехмерной структуры РНК? Эрик Вестхоф привлек со всего мира специалистов по изучению структуры РНК к игре, которую он назвал «РНК-пазл»[131]. Когда кто-либо из участников расшифровывал строение очередной РНК, например с помощью кристаллографии, он соглашался задержать публикацию решения, чтобы у других игроков оставался месяц на выработку своего предложения на основе одной лишь последовательности. Проще говоря, игроки не знали уже полученного кем-то ответа. Одни для предсказания структуры разрабатывали автоматические веб-серверы, другие делали это вручную. Все решения собирались, и, когда заканчивался срок сдачи вариантов, раскрывалась истинная структура РНК.
Для всех четырех предложенных РНК-пазлов метод ИИ Даса и Дрора дал самую точную из предложенных версий. Этот алгоритм еще не совершенен, но он уже близок к тому, чтобы стать надежным инструментом для сообщества исследователей. Насколько можно судить, в будущем подобные структуры будут определяться без лабораторных экспериментов и расчетов – отличная перспектива для научного прогресса, но немного грустно для тех из нас, кто годами занимался стряпней по молекулярным рецептам и затем смаковал результат.
Получение трехмерного изображения тРНК, а затем и рибозимов сильно повлияло на изучение РНК. Ученые смогли увидеть, как тРНК складывается, чтобы потом разместиться в рибосоме, доставив туда нужную аминокислоту и расположив ее так, чтобы соседние аминокислоты могли прореагировать в процессе образования пептидной цепочки. Ученым удалось понять на уровне отдельных атомов, как рибозим тетрахимены располагает гуанозин для атаки на сайт сплайсинга РНК, как РНКаза P катализирует разрушение определенных связей, чтобы получить зрелую тРНК, и как мяРНК организуют сплайсинг мРНК. Мы не только пытаемся разобраться, как устроена природа; знание структуры РНК позволяет ученым и биоинженерам создать рибозимы, которые в составе молекулярных систем могут выявлять токсичные вещества или определенные вирусы в пробах, взятых из окружающей среды. Есть целая область в синтетической биологии, где рибозимы используются в качестве сенсоров и переключателей, и для этого вначале надо было узнать строение РНК.
Успешное определение трехмерной структуры все более крупных молекул РНК вдохновляло исследователей в этой области на новые свершения. Несколько бесстрашных ученых нацелились даже на последний оплот клетки, главную молекулярную машину, устройство которой долгое время было покрыто тайной. Они решили разгадать структуру рибосомы.