Трудно представить более идиллическое место для научного симпозиума, чем лаборатория Колд-Спринг-Харбор. Она расположена на острове Лонг-Айленд и больше похожа на летний лагерь, чем на исследовательский центр: среди холмов, которые весной украшаются цветущими магнолиями, азалиями и кизилом, стоят дощатые домики, а на ветру покачиваются парусные лодки. Лаборатория была основана в 1890 г. и всегда имела репутацию серьезного, хоть и несколько сонного научного учреждения. Именно здесь начиная с 1940-х гг. генетик Барбара Мак-Клинток в уединении проводила свои кропотливые эксперименты, отслеживая вариации окраски кукурузных зерен, чтобы определить, как функционируют в клетках гены и хромосомы. Ее открытие «прыгающих генов» в итоге было удостоено Нобелевской премии.
Сонливость быстро слетела с лаборатории Колд-Спринг-Харбор, когда в 1968 г. ее директором стал Джим Уотсон. Он был столь проницательным, амбициозным и напористым, что быстро превратил лабораторию в мощный центр, который выдавал одно крупное научное открытие за другим. В тот период лаборатория стала знаменита проводившимися там конференциями, на которых молекулярные биологи делились своими недавними находками. Она была и остается местом, где можно сразу узнать о новейших достижениях, без многомесячного ожидания публикации, и наладить новое сотрудничество.
В июне 1977 г. темой симпозиума в Колд-Спринг-Харбор стала структура и функции хромосом у высших организмов. В то время я был научным сотрудником в Массачусетском технологическом институте, работал именно в данной области и очень обрадовался возможности посетить симпозиум. До сих пор помню сильнейшее восхищение, когда две группы исследователей, одной из которых руководил мой сосед по МТИ Фил Шарп, а другой – Рич Робертс из Колд-Спринг-Харбор, вышли выступать и рассказали о решении загадки, над которой ученые бились более десяти лет.
Что же это была за великая тайна? После того как на примере кишечной палочки и ее фагов была выявлена связь между ДНК, мРНК и белком, многие ученые переключились на исследование более сложных организмов, таких как растения, животные и особенно человек. Имелись все основания ожидать, что фундаментальные принципы хранения и передачи биологической информации будут неизменны у всех форм жизни. Как однажды сказал нобелевский лауреат Жак Моно, «то, что верно для кишечной палочки, должно быть верно и для слона»[39]. Но когда биохимики изучили человеческие клетки, выращенные в чашках Петри в термостате, они пришли в замешательство. Предполагалось, что мРНК сначала обнаружится в клеточном ядре, где находился ее хромосомный прародитель – ДНК. И в самом деле, РНК нашлась в ядре, но она казалась слишком большой, чтобы быть готовой мРНК, – в среднем в 10 раз больше[40], чем требуется для кодирования белка. Это казалось странным, ведь мРНК, которая поступала из ядра в цитоплазму, была как раз нужного размера, чтобы кодировать белок.
Действительно ли эта огромная РНК, найденная в ядре клетки, должна была превратиться в мРНК? Если да, то что делали все эти лишние нуклеотиды в ядерной РНК, коль скоро они не кодировали белок? В тот день в Колд-Спринг-Харбор ответ был обнародован, и он стал первым сигналом к пониманию того, что РНК способна на большее, чем просто передавать информацию от ДНК.
Я работал через дорогу от лаборатории Фила Шарпа в МТИ, но это еще не означало, что я мог непосредственно наблюдать открытие Фила. Иногда я пересекал Эймс-стрит и заходил в его лабораторию в Онкологическом центре, чтобы посоветоваться насчет проблем с экспериментами. Там работала моя приятельница Клэр Мур, и они с Филом всегда охотно обсуждали мои исследования, но дружно отмалчивались по поводу своих собственных.
Это было довольно странно. Ученые, как правило, не могут удержаться, чтобы не рассказать о своей работе, о потрясающем открытии, которое может случиться в ближайшем будущем. Однако Фил, Клэр и постдокторант Сью Берже знали, что нашли что-то особенное, и не хотели поднимать шум. И только год спустя, сидя в аудитории Колд-Спринг-Харбор, я узнал, как Фил и Рич Робертс решили загадку[41] про неподходящий размер человеческой мРНК.
Ключ к разгадке был получен благодаря аденовирусу – ДНК-вирусу, вызывающему у людей обычную простуду. Подобно тому как бактериофаги помогли первым молекулярным биологам понять принципы работы генов у бактерий, человеческие вирусы подсказали подход к изучению молекулярных особенностей биологии человека. В конце концов, и фаги, и человеческие вирусы обманом заставляют клетки своих хозяев обеспечить инфекционный цикл вируса за счет ресурсов клетки, поэтому паразиты должны использовать те же фундаментальные биологические механизмы, что используют их хозяева. Изучение вирусов имеет и практические преимущества: зараженные клетки содержат множество копий вирусной ДНК и соответствующую полученную РНК; таким образом, исследователи получают много материала для работы.
Обе группы, из МТИ и Колд-Спринг-Харбор, сначала составили карты расположения разных генов в хромосоме аденовируса. Они не ожидали, что это приведет к какому-то крупному открытию, картирование требовалось, просто чтобы получить необходимую информацию для дальнейшей работы – предстояло выяснять, как экспрессируются вирусные гены. Сравнивая вирусную ДНК с ее мРНК-копией из цитоплазмы клетки, исследователи ожидали, что ДНК и мРНК будут соответствовать друг другу в пределах всей последовательности. Разумеется, у бактерий было бы именно так.
Однако обнаружилось, что длинные внутренние участки мРНК, которые должны были бы присутствовать, если бы мРНК была непосредственной копией ДНК, просто исчезли. Оказалось, что мРНК собиралась из кусочков, некоторые фрагменты из середины были вырезаны, а концевые участки последовательности соединены друг с другом. Исследователям пришлось признать, что кодирующие области генов аденовируса не были непрерывными, а состояли из фрагментов, разделенных участками некодирующей ДНК, которые мы теперь называем интронами.
Слушатели этого доклада в Колд-Спринг-Харбор были ошеломлены. Сам Джим Уотсон, присутствовавший в тот день в аудитории, называл это открытие «бомбой». Считалось, что матричная РНК – непрерывная копия своего гена. Это казалось единственным эффективным вариантом, и сложно было понять, почему белок-кодирующие участки ДНК могут быть разделены интронами и как эти интроны могут вырезаться. Являлись ли все эти сложные операции, в ходе которых фрагменты генетической информации попадали в ДНК, но исключались из мРНК, просто бессмысленной акробатикой, неким эволюционным танцем, никуда не приводящим? Или в процессе такого вырезания и соединения выполнялись какие-то важные задачи? Какое-то время мир молекулярной биологии сосредоточился на этом вопросе, изо всех сил пытаясь найти ответ.
Большинство белок-кодирующих генов у человека и многих других эукариотов прерываются участками некодирующей ДНК, называемыми интронами. Каждый интрон (на схеме он светло-серый) транскрибируется как часть РНК-предшественника (в середине), который потом подвергается сплайсингу до функциональной мРНК (внизу)
Вскоре выяснилось, что все обстоит еще сложнее. Ученые начали понимать, что интроны встречаются не только у вирусов, а характерны и для эукариотов – организмов, хранящих свою ДНК в ядре. Как только было объявлено о существовании интронов у аденовирусов, многие ученые в лабораториях по всему миру поняли, что в генах, которые они изучают, тоже вставлены интроны. Например, уже в 1977 г. биологи из Гарварда Ширли Тилгман[42] и Фил Ледер обнаружили, что кодирующая последовательность человеческого гена белка крови гемоглобина разделена двумя интронами. И интроны, и кодирующие участки копировались с гена, так что в ядре клетки образовывалась длинная молекула РНК, но затем, прежде чем мРНК попадала в рибосомы для образования белка, мать-природа доставала секатор[43] и волшебным образом вырезала вставки.
Для описания этого процесса Фил Шарп использовал слово сплайсинг – так в морском деле называется прием, используемый при ремонте канатов. Моряк может обрезать канат выше и ниже обветшавшего участка, выбросить поврежденный кусок и соединить вместе концы двух крепких частей веревки, переплетя их.
Можно представить себе интрон как несколько бессмысленных слов, последовательность «бла-бла-бла», прерывающих осмысленное высказывание, вроде «Вы сегодня очень приятно бла-бла-бла-бла-бла пахнете». С помощью текстового редактора нетрудно это быстро исправить. Достаточно выделить неуместную вставку, нажать кнопку «удалить» – и все «бла» будут вырезаны, а останется лишь «Вы сегодня очень приятно пахнете». Природа использует аналогичный способ для удаления интронов из мРНК, чтобы получить чистую последовательность, которая требуется при производстве белка.
Теперь ученые поняли, почему РНК, созданная в ядре и содержащая все эти интроны, изначально была значительно длиннее, чем мРНК, из которой интроны были вырезаны. Но, как обычно случается в науке, один решенный вопрос потянул за собой другие. Какова функция у этих интронов? Действительно ли они бесполезны, как считали некоторые ученые? Или с их помощью мы сможем понять не только чем отличается слон от кишечной палочки, но и что делает нас людьми?
Геномом называют совокупность ДНК во всех хромосомах организма. До того как примерно в 2000 г. был секвенирован[44] человеческий геном, мы понятия не имели, сколько генов нужно человеку для выработки всех необходимых белков, благодаря которым мы – это мы. Незнание не мешало нам строить предположения, большинство из которых оказались абсолютно ошибочными.
В заблуждение нас ввели дрожжи. Да, те самые дрожжи, благодаря которым поднимается тесто и бродят пиво и вино. Дрожжи – одноклеточные организмы. У них нет ни мозга, ни сердца, ни рук, ни ног, ни желудка, ни печени, ни кишечника. Нет и репродуктивных тканей. При размножении у них образуется маленькая почка, которая становится все больше и больше, затем отрывается и становится новой клеткой. Поэтому казалось вполне очевидным, что дрожжам для обеспечения жизнедеятельности нужно гораздо меньше генов, чем человеку, состоящему из сотен разных по типу клеток.
Геном дрожжей был секвенирован в 1996 г., он стал первым секвенированным геномом эукариотического организма. И оказалось, что геном дрожжей состоит примерно из 6000 кодирующих белки генов[45][46]. В это время проект «Геном человека» еще только начинался и даже принимались ставки – кто точнее угадает, сколько генов окажется у человека. Конечно, их намного больше, чем у примитивных дрожжей. Известные научные авторитеты на своих лекциях прогнозировали для человека 100 000 и более генов.
Поэтому вы можете представить себе, как были потрясены ученые, когда в 2003 г. наконец была обнародована последовательность генома человека и мы узнали, что у человека примерно 24 000 белок-кодирующих генов[47], то есть всего в четыре раза больше, чем у примитивных дрожжей. Как такое может быть? Казалось, это не согласуется со здравым смыслом. И люди, и дрожжи – организмы, хранящие наследственную информацию в виде ДНК. Почему же у нас генетических возможностей оказалось намного больше, чем у наших грибных родственников, оставшихся на нижней ступеньке?
Ответ в значительной степени связан с «бессмысленными» интронами. У дрожжей в большинстве генов нет интронов, а если есть, то обычно это всего один интрон, а потому сплайсинг РНК может происходить лишь одним способом. Но у человека интроны оказались отнюдь не помехами. Они весьма полезны. С их помощью в РНК могут соединяться разные фрагменты, и в результате при таком же количестве генов удается получить больше разных белков.
Первые примеры такого альтернативного сплайсинга мРНК были обнаружены в 1980 г., вскоре после открытия самого процесса сплайсинга. Альтернативный вариант сплайсинга может совершаться, например, когда вырезается один из кодирующих участков, как показано на рисунке.
Альтернативный сплайсинг мРНК позволяет получить несколько белков одного гена. Поскольку у большинства человеческих генов не менее двух интронов, сплайсинг РНК может происходить разными способами. Сверху: при независимом сплайсинге двух интронов получается мРНК, кодирующая одну из форм белка. В середине: при сплайсинге выпадает один из кодирующих участков, и в итоге у белка отсутствует центральный фрагмент. Внизу: при использовании альтернативного места (сайта) сплайсинга образуются более длинная мРНК и белок с дополнительным фрагментом
Вернемся к нашей условной фразе, но сейчас она будет содержать два интрона: «Вы сегодня очень бла-бла приятно бла-бла-бла-бла-бла пахнете». При обычном сплайсинге вырезаются оба интрона, и окончательный вариант прозвучит так: «Вы сегодня очень приятно пахнете». Но «приятно» может быть выброшено, и тогда «очень» и «пахнете» окажутся рядом. В результате альтернативного сплайсинга фраза станет «Вы сегодня очень пахнете», где есть большинство слов из предыдущей версии, но смысл совершенно иной.
Такой альтернативный сплайсинг, когда из одной фразы получаются несколько фраз, разных по значению, позволяет при ограниченном размере генома вырабатывать более сложный набор белков, что приводит к появлению более сложных организмов[48]. Это важный момент, поскольку за счет альтернативного сплайсинга с одного человеческого гена в среднем получается четыре-пять разных мРНК и белков. Вот она, важная особенность, позволяющая неожиданно малому по размеру человеческому геному сделать нас такими, какие мы есть.
Один из моих любимых примеров альтернативного сплайсинга мРНК можно найти у нас в иммунной системе, а именно в B-лимфоцитах – белых клетках крови. Эти клетки вырабатывают антитела – белки, способные защищать нас от инфекций, распознавая и нейтрализуя патогены, проникшие в наш организм. На ранней стадии жизни В-лимфоцита антитела располагаются на внешней поверхности этой клетки, ожидая появление патогена, для которого опасен охранник именно данного типа. Таким патогеном может быть, например, коронавирус. Затем В-лимфоциты переключаются на выделение антител, которые циркулируют по кровеносной системе и, опять же, связываются с вирусами подходящей формы. В первом случае антитела стоят на страже, во втором – преследуют захватчика.
Эти два типа антител – рецепторы на поверхности клеток и циркулирующие по кровотоку – одинаковы в том участке, которым они прикрепляются к вирусу, но отличаются друг от друга другим концом. У тех, которые прикреплены к В-лимфоциту, гидрофобный конец удерживается в клеточной мембране, а у свободно плавающих антител второго типа конец покрыт углеводной оболочкой[49], позволяющей белку высвободиться из клеточной мембраны и перемещаться с кровотоком. Обе формы кодируются у человека одним и тем же геном. РНК, скопированная с этого единственного гена[50], может подвергнуться сплайсингу двумя способами, так что получатся два лишь частично сходных белка. Сравните: «Вы сегодня очень приятно пахнете» и «Вы сегодня очень пахнете». Благодаря альтернативному сплайсингу можно, таким образом, весьма эффективно использовать один и тот же ген для решения двух разных задач.
Итак, в чем же разница между слоном и кишечной палочкой? В сплайсинге.
Способность животных создавать огромные предшественники мРНК, а затем разрезать и соединять фрагменты для получения нужных мРНК, была ошеломительным открытием. Но то, что ученые открыли сплайсинг, еще не означало, что они поняли, как этот процесс происходит. Предстояло постичь главное: как определяются интроны, которые нужно удалить. Места сплайсинга должны были распознаваться с исключительной точностью, поскольку пропуск даже одного основания приводил бы к сдвигу рамки считывания, изменению всех последующих кодонов и нарушению функции белка.
Джоан Стейц, подобно многим другим ученым, совершившим революционные открытия, воспользовалась несколькими счастливыми случайностями, чтобы понять, как сама природа пометила места сплайсинга. В 1963 г. Джоан поступила в Гарвардский университет на новую там программу по биохимии и молекулярной биологии, оказавшись единственной женщиной среди аспирантов ее потока и первой женщиной-аспирантом[51] в исследовательской группе Джима Уотсона. После защиты диссертации по РНК бактериофагов она вместе с мужем, тоже биохимиком, Томом Стейцем отправилась в Англию, в знаменитую лабораторию молекулярной биологии в Кембриджском университете. Там Джоан сотрудничала с такими учеными, как Фрэнсис Крик и Сидней Бреннер. Потом супруги Стейц работали в Калифорнийском университете в Беркли. Том получил должность профессора, но вскоре стало ясно, что Джоан там сможет работать только в качестве его ассистента. Руководитель кафедры биохимии сказал ей: «Всем нашим женам нравится быть ассистентами у своих мужей»[52]. Поэтому пара быстро переместилась в Йельский университет, где в 1970 г. оба получили независимые профессорские должности.
В Йеле Джоан заинтересовалась длинными РНК, образующимися в ядрах клеток млекопитающих. Оставалось еще несколько лет до открытия интронов, поэтому тогда было непонятно, что длинные РНК – это предшественники мРНК. Джоан хотела получить антитела, которые можно было бы использовать в качестве инструментов для выявления и возможного подавления активности белков, связанных с такими крупными ядерными РНК. В ходе экспериментов крысам вводили соответствующий белок, чтобы иммунная система грызунов, воспринимающая человеческий белок как чужеродный, выработала против него антитела, так же как она это делает для борьбы с вирусами. Попытки Джоан заставить крыс вырабатывать такие антитела были болезненными, причем в буквальном смысле. У нее до сих пор сохранился шрам на пальце в месте крысиного укуса.
В 1979 г. Джоан узнала, что пациенты с системной красной волчанкой – заболеванием, при котором иммунная система человека атакует собственный организм, – вырабатывают антитела к веществам, присутствующим в ядрах их собственных клеток. Может быть, эти антитела распознают белки, связанные с ядерной РНК? Она отправила Майкла Лернара – студента-медика из своей лаборатории – через дорогу, в отделение иммунологии Йельского университета, чтобы добыть от таких пациентов образцы сыворотки с антителами.
Вскоре Джоан и Майкл выяснили, что у больных волчанкой вырабатываются антитела к белкам, связанным с малыми РНК, содержащимися в ядрах собственных клеток[53]. Это было плохой новостью для больных волчанкой – ведь антитела должны, как правило, вырабатываться против чужеродных агентов, а не против компонентов собственных клеток. Но это было хорошей новостью для ученых, потому что такие малые ядерные РНК (мяРНК) помогли понять чудо мРНК-сплайсинга. О существовании мяРНК уже было известно[54]. Всего их насчитывали шесть вариантов, и, поскольку в них много урацила (в РНК он обозначается U), им дали названия от U1 до U6. Но функции мяРНК по состоянию на 1979 г. оставались неизвестны.
К тому времени прошло уже два года с момента сенсационного сообщения в Колд-Спринг-Харбор об интронах, разделяющих гены на кусочки, и уже было найдено множество других интронов у человека. Теперь всем хотелось понять, как клетки контролируют сплайсинг и определяют, какие фрагменты им надо сохранить в мРНК, а какие вырезать. Этот вопрос постоянно обсуждался в лабораториях, изучавших РНК, и в лаборатории Джоан в том числе. Джоан знала, что интроны бывают разных размеров и с разной последовательностью нуклеотидов. Но концы интронов выглядели почти одинаково: все они начинались с ГУААГУ и заканчивались на АГ. Джоан прекрасно понимала, что за счет комплементарности одноцепочечные участки молекул РНК предрасположены к спариванию[55] с одноцепочечными участками других РНК, имеющих соответствующие основания. Поэтому можно было предположить, что одинаковые (консервативные) последовательности на концах интрона могут быть распознаны и помечены как места сплайсинга с помощью соединения с одной из мяРНК. Джоан и Майкл Лернер проверили, есть ли совпадение в последовательностях, и нашли его. Участок на одном из концов мяРНК U1 был комплементарен началу интрона у человека, по крайней мере, так это следовало из их записей. Совпадение казалось слишком удачным, чтобы быть случайным, поэтому исследователи смело предположили вероятность того, что U1 определяет начало каждого интрона[56], помогая сделать разрез именно в этом месте.
Через несколько лет эту гипотезу подтвердили с помощью ряда экспериментов. Например, в лаборатории Фила Шарпа была разработана методика, позволяющая наблюдать за реакцией сплайсинга РНК в пробирке, и в совместной работе группы Фила и Джоан проверяли, будут ли антитела к белку, связанному с мяРНК, подавлять сплайсинг. Если мяРНК U1 действительно распознает место начала сплайсинга, антитела подавят сплайсинг. В результате совместных исследований именно это явление и было обнаружено[57].
За счет комплементарности мяРНК U1 определяет местоположение начала интрона, обозначая, таким образом, место сплайсинга. Комплементарная пара А-У в РНК аналогична комплементарной паре А-Т в ДНК
А как насчет консервативного участка АГ на другом конце каждого интрона? Там ситуация оказалась немного сложнее. МяРНК U2 действительно соединяется с комплементарной последовательностью в конце интрона, но АГ участок распознается благодаря белку, связанному с мяРНК U2[58].
После открытия того факта, что мяРНК участвует в сплайсинге мРНК, в список функций РНК добавилась еще одна: РНК может отмечать нужный участок, подобно тому как можно поставить метку на карте в интернете. Логично было ожидать такую функцию у одноцепочечной РНК, поскольку она всегда готова соединить основания А с У и Г с Ц. Мы наблюдали это уже не впервые: сначала на примере соединения антикодонов транспортной РНК с кодонами мРНК, теперь у мяРНК, присоединяющихся рядом с местом сплайсинга.
Вырезание интронов происходит с поразительной точностью, но ничто в природе не совершенно. Ошибки случаются, и, когда речь идет об интронах, нарушение сплайсинга может повлечь разрушительные последствия.
Обычно если какой-либо биохимический процесс важен для здоровья человека, то существуют заболевания, возникающие при нарушении этого процесса. И действительно, в 1981 г., то есть спустя всего четыре года после того, как был открыт сплайсинг мРНК, нашли первое заболевание, которое может быть вызвано нарушением сплайсинга, – бета-талассемию.
Это одно из самых распространенных генетических заболеваний в странах Средиземноморья, Азии и Ближнего Востока. Больные бета-талассемией страдают от анемии, то есть у них меньше эритроцитов, поэтому организм получает недостаточно кислорода, что приводит к сильной утомляемости и повышенному риску ранней смерти. Белок гемоглобин, который содержится в эритроцитах и переносит кислород, состоит из четырех аминокислотных цепочек: двух одинаковых альфа-цепей и двух одинаковых бета-цепей. Больные бета-талассемией страдают от анемии, потому что в их гемоглобине не хватает бета-цепей. Для другого заболевании, тоже поражающего эритроциты, – серповидно-клеточной анемии – характерна мутация в гене, отвечающем за синтез бета-цепи, но при бета-талассемии иногда в кодирующей части последовательности не находят мутации, которая могла бы объяснить возникновение заболевания.
Шерман Вайсман и его коллеги в Йельском университете заинтересовались случаем двенадцатилетней греко-кипрской девочки[59], которой в ходе лечения от бета-талассемии делали переливания крови. Ученые выделили ген бета-цепи гемоглобина девочки, расшифровали его последовательность и решили загадку: мутация была не в части, кодирующей мРНК, а в интроне. Из-за мутации возникла последовательность АГ, похожая на место сплайсинга, из-за чего система сплайсинга ошибалась и разрезала РНК в неправильном месте. Позднее в том же году исследователи из Лондона убедительно показали, что мутация в интроне приводила к ошибочному сплайсингу мРНК[60]. Всякий раз, когда система сплайсинга сталкивалась с этим мутантным участком, образовывалась аномальная мРНК, которая больше не кодировала бета-цепь гемоглобина. Хотя сплайсинг РНК иногда может быть причиной заболевания, как в этих случаях с бета-талассемией, он способен стать также и средством лечения. Спинальная мышечная атрофия (СМА) впервые была описана врачами в 1890 г. Это разрушительное нейродегенеративное заболевание встречается у одного из 11 000 младенцев, то есть достаточно часто. Дети со СМА страдают от прогрессирующей мышечной слабости и утраты подвижности, и многие из них умирают, не дожив до двух лет. Это генетическое заболевание, вызванное мутацией в гене SMN1 (ген выживаемости моторных нейронов 1)[61]. У здоровых людей на основе гена SMN1 вырабатывается белок, который помогает мяРНК объединяться со своими белковыми партнерами[62]. Поскольку это важно для всех типов клеток, не вполне понятно, почему именно моторные нейроны особенно чувствительны к отсутствию SMN белка, тем не менее это так[63].
Таким образом, если ученые хотят вылечить СМА, им надо придумать, как компенсировать отсутствие белка SMN. Оказывается, в геноме человека часто встречается дублирование генов и существует второй ген выживаемости моторных нейронов, а именно SMN2, кодирующий тот же белок, что и ген SMN1. Важно, что у SMN2 другие интроны. Когда происходит сплайсинг его мРНК, обычно пропускается важный фрагмент кодирующей последовательности и получается нефункциональная мРНК, с которой невозможно получить работающий белок SMN. Но что, если попытаться настроить сплайсинг РНК гена SMN2 так, чтобы он компенсировал невозможность получить нужный белок из-за мутации в гене SMN1?
В 2002 г. Адриан Крайнер из лаборатории Колд-Спринг-Харбор нашел способ восстановить сплайсинг SMN2, чтобы компенсировать неработающий SMN1. Он определил в мРНК гена SMN2 участок, мешающий правильному сплайсингу. Альтернативный сплайсинг мРНК часто регулируется так называемыми факторами сплайсинга – тканеспецифичными белками, которые связываются с конкретными участками на предшественнике мРНК и усиливают или ослабляют вероятность использования определенных сайтов сплайсинга. Эти сайты формировались так, чтобы регулировать сплайсинг у здорового организма, но в данном случае фактор сплайсинга мешал нормальному процессу. Адриан предположил, что если как-то удастся прикрыть или спрятать эту мешающую последовательность, то можно восстановить нормальный сплайсинг SMN2[64].
Чтобы проверить эту идею, Адриан начал сотрудничать с биофармацевтической компанией Ionis в Сан-Диего, которая специализировалась на создании лекарств с использованием антисмысловых РНК. Эти РНК сконструированы таким образом, что содержат последовательности, комплементарные определенной РНК организма. Например, если в мРНК есть последовательность ГГГ, кодирующая аминокислоту глицин, то антисмысловую РНК сделают так, чтобы у нее была последовательность ЦЦЦ. В таком случае антисмысловая РНК будет связываться с заданной РНК за счет комплементарности Г-Ц, механически блокируя присоединение к ней белка.
Адриан совместно с компанией Ionis решили разработать антисмысловую РНК, которая связывалась бы с участком, мешающим правильному сплайсингу РНК гена SMN2, и «скрывала» бы этот участок, а также содержала бы некоторые химические модификации, чтобы облегчить доставку лекарства в нужное место организма. После нескольких лет работы идея получила реальное воплощение[65] и удалось восстановить выработку функционального белка сначала в культуре клеток, а затем у генетически модифицированных мышей с той же мутацией, которая приводит к развитию СМА у человека.
Главной проверкой стали клинические исследования на реальных пациентах. За время изучения этого заболевания Адриан познакомился с семьей на Лонг-Айленде, где у девочки по имени Эмма Ларсон была диагностирована СМА средней тяжести, – ген SMN1 у Эммы частично работал. До года девочка нормально развивалась, потом ей вдруг стало трудно держать бутылочку и даже удерживать голову. Родители Эммы были полны решимости сделать все возможное для своей маленькой, сильной духом дочки и ухватились за возможность включить ее в клинические исследования лекарства на основе антисмысловой РНК.
Мама Эммы рассказывает, что произошло, когда дочке ввели вторую дозу антисмыслового препарата, сейчас известного под названием «нусинерсен»[66]. «Я была в спальне, – вспоминает Диана Ларсон. – Эмма оставалась в другой комнате. Напомню, она не может сама передвигаться дальше чем на несколько футов. Внезапно я слышу, что ее голос раздается все ближе и ближе. Что она делает? "Эмма?" – говорю я. В следующий момент я понимаю, что она рядом со мной на полу спальни, прямо у двери. Я была потрясена! Я не могла поверить, что она проделала весь этот путь из другой комнаты»[67].
Нусинерсен оказал положительное влияние не только на Эмму, но и на других участников клинических испытаний. Результат был настолько хорош, что Администрация по контролю за продуктами питания и лекарственными препаратами[68] завершила испытания на год раньше срока и одобрила препарат. К 2020 г. нусинерсен получали 8 000 больных СМА в 40 странах. Он не дает излечения: ведь к тому моменту, когда применяется препарат, нейроны уже получают необратимые повреждения. Но он спасает жизни. В будущем хотелось бы выявлять данный генетический дефект еще у новорожденных и начинать лечение сразу же, предотвращая развитие СМА.
Успешное применение нусинерсена вызвало повышенный интерес к антисмысловым препаратам и к их способности направлять сплайсинг РНК нужным образом. Например, мышечная дистрофия Дюшенна – изнурительное генетическое заболевание с прогрессирующей потерей мышечной функции из-за отсутствия критически важного белка дистрофина. Состояние пациента, страдающего этим заболеванием, может быть улучшено, если изменить характер сплайсинга РНК и получить таким образом недостающий белок[69]. И, напротив, многие распространенные виды рака, такие как рак поджелудочной железы, легких и толстой кишки, связаны с патогенным белком, поэтому антисмысловые РНК, подавляющие сплайсинг, потенциально могут остановить выработку такого вызывающего рак белка и предотвратить развитие болезни. Как мы увидим дальше, многие заболевания у людей стимулируются патологическими процессами, сопряженными с РНК. Поэтому у терапии с использованием антисмысловых РНК в будущем большие перспективы.
С открытием сплайсинга стало ясно, что матричная РНК не всегда представляет собой непосредственную копию информации, хранящейся в двойной спирали ДНК. У высших организмов, в том числе у человека, для получения мРНК сначала происходит точное копирование всей информации с ДНК, включая большие участки интронов, которые не войдут в итоговую молекулу. Затем в процессе сплайсинга РНК интроны вырезаются, кодирующие участки соединяются вместе и образуется мРНК, которая выходит из клеточного ядра и взаимодействует с рибосомами. На первый взгляд этот процесс кажется чудовищно неэффективным: зачем природе прерывать кодирующие участки интронами, чтобы потом вырезать их из РНК? Но у всех этих фокусов есть большой смысл. Возможность альтернативного сплайсинга придает геному ограниченного размера непредставимую ранее гибкость и помогает нам стать теми, кто мы есть.
При изучении механизмов сплайсинга выяснилось, что в репертуаре РНК есть еще дополнительные трюки. Так, малые ядерные РНК необходимы для точной маркировки мест сплайсинга. Эти мяРНК наряду с транспортными и рибосомными РНК, играющими важнейшую роль в биологии клетки, были причислены к группе так называемых некодирующих РНК. Но впереди было нечто гораздо большее. Вскоре ученые выяснили, что некодирующие РНК способны не только участвовать в синтезе белка и маркировать нужное место. Они могут сами управлять происходящим. Во многих важных клеточных процессах РНК действует как катализатор.