По окончании академии в 1883 г. Гамалея вернулся домой, в Одессу, где устроился ординатором в клинике нервных болезней Мочутковского.

Изучая действие слабых раздражений на восстановление чувствительности в парализованных конечностях, он конструирует аппарат, способный производить продолжительные минимальные раздражения, и испытывает его на больной, получая ошеломляющий результат, – после двухлетнего пребывания в клинике с полным параличом нижних конечностей пациентка выздоравливает.

Но продолжить занятия невропатологией Гамалее не удалось – жизнь распорядилась иначе.

Тогда же, вдохновленный работами Пастера и открытием фагоцитоза Мечниковым, он устраивает дома микробиологическую лабораторию. Так как Илья Ильич не имел медицинского образования, руководителем лаборатории стал Гамалея. Работая с Мечниковым, Гамалея помогает ему в получении чистых культур для исследований по фагоцитозу и одновременно осваивает микробиологические методы.

В 1885 г. Пастером была сделана успешная прививка против бешенства, и общество врачей по рекомендации Мечникова командирует молодого врача в Париж для ознакомления с методом приготовления вакцины.

В Латинском квартале, находилась бактериологическая станция Луи Пастера, с которым вскоре у Гамалеи начались разногласия. По мнению Пастера, открывать пункты вакцинации против бешенства в других странах не было смысла, ведь в неопытных руках новый метод прививок может быть неправильно применён, следовательно, и дискредитирован. Но, с другой стороны, одесский медик прекрасно понимал, что не в состоянии Пастер и его сотрудники излечить всех больных, поступающих из разных стран.

А тут сама жизнь показала правоту Гамалеи.

Преодолев огромное по тем временам расстояние, из России в Париж прибыла большая группа крестьян, покусанных бешеным волком. Их привили. И вот здесь случилась неудача: из девятнадцати привитых крестьян трое умерли. Оказалось, что после укусов волка прошло слишком много времени, прививки были проведены с опозданием. Больные из России могли бы быть спасены, если бы не потеряли столько времени на поездку во Францию.

Пастер пришёл к выводу: организация бактериологических станций, прививочных против бешенства в других странах целесообразна.

В течение пяти лет, время от времени наезжая в родную Одессу, Николай Гамалея приобретал неоценимый в теоретическом и практическом отношении опыт. В какой-то момент он искренне поблагодарил за доверие, перспективу блестящей научной карьеры, но сказал: «Дорогой учитель, у меня на родине ежегодно тысячи людей умирают от инфекционных болезней, меня там ждут, мое место там…».