Как и положено мальчику из хорошей дворянской семьи, Коля получил гимназическое образование. Ещё в младших классах он познакомился с книгой английского физика Майкла Фарадея «История свечи». Николай Федорович писал:

«Она произвела на меня глубочайшее впечатление и навсегда привила любовь к естествознанию. Становясь старше, я стал читать подробные сочинения по физике, химии, биологии. В последних классах я прочел книгу Грота «О соотношении физических сил» и, будучи хорошо знаком с физикой, проникся значением закона сохранения и превращения энергии. Я ознакомился с дарвинизмом по популярной книге Ралле, а затем стал увлекаться сочинениями Спенсера, открывшего передо мною мир эволюции».

По окончании частной гимназии Гамалея успешно сдал выпускные экзамены и поступил в Новороссийский университет на естественное отделение физико-математического факультета. Там зоологию преподавал Илья Мечников.

Идея эволюционного развития, заброшенная в массы Чарльзом Дарвином, захватила Николая. Он организовал студенческий кружок для более глубокого изучения литературы, посвящённой эволюции. Рассматривая изменение форм организмов как частный случай эволюционной теории, Гамалея предположил, что обязательно должен меняться и состав организма. Учась в университете, три летних каникулярных месяца Гамалея ежегодно проводил в Страсбургском университете в лаборатории профессора Ф. Гоппе-Зейлера, изучая биохимию.

Получив степень магистра естествоведения, Николай Гамалея поехал поступать петербургскую военно-медицинскую академию, где его приняли сразу на третий курс. В 1883 году он блестяще закончил академию. Вот так страстное увлечение наукой создало у Гамалеи иммунитет к очень распространённой в то время, наряду с гонореей, в студенческой среде инфекции – народовольчеству.

Ему предлагали остаться в Петербурге, но судьба вновь свела его с профессором И.И. Мечниковым, который принял приглашение одесских властей помочь им в борьбе с инфекционными болезнями, «облюбовавшими» южные губернии России. Особенно остро это было в Одессе – порту, куда приходили корабли из южных стран, где свирепствовала разнообразная зараза.