Что находится за границами гена KIT? Наверное, разные его регуляторы (энхансеры и сайленсеры). Раньше думали, что они могут находиться где угодно. Несколько лет назад возникло предположение, что регуляторы должны быть рядом с генами, которые они регулируют. Мало того, они должны быть надежно отгорожены от других генов и их регуляторов. Возникло это предположение благодаря открытию топологически ассоциированных доменов (ТАД)²⁷, внутри которых последовательности ДНК физически взаимодействуют друг с другом чаще, чем с последовательностями за пределами ТАДа.

ТАД можно сравнить с жителями одной квартиры. Кошка живет со своим котенком, в их же доме живет человек – это один ТАД, все его участники часто друг с другом контактируют. Иногда к человеку приходят гости, иногда кошка бывает у ветеринара – это редкие взаимодействия между соседними ТАДами. А вот на Шпицбергене кошка никогда не бывала (и, скорее всего, никогда не будет, потому что кошкам вход на Шпицберген запрещен) – разные хромосомы друг с другом почти никогда не контактируют.

Вскоре были определены средние размеры ТАД. Они варьировали от класса к классу в соответствии с вариациями общего размера генома. У млекопитающих они были втрое больше, чем у птиц, и в 10 раз меньше, чем у лягушек! Зато их границы оказались одинаковыми (если при сравнении учесть разницу размеров генома).

Зачем нужны ТАДы, до сих пор не очень понятно. Исследователи полагают, что важны даже не сами ТАДы, а границы на замке между ними. Взаимодействие регуляторов с промоторами разрешается только внутри ТАДа, а посторонним регуляторам вход категорически запрещен. Границы между домами (границы ТАДа) строго охраняются, чтобы чужак из соседнего дома не пришел и не стал давать указания жильцам не в своем доме (чтобы регулятор из одного ТАДа не включал/выключал гены в соседнем ТАДе).

Когда исследователи присмотрелись к клиническим случаям, оказалось, что нарушение границ ТАДа ведет к развитию рака, дефектам развития конечностей и мозга. Но это все были случаи спонтанных и, стало быть, нерегулируемых нарушений границ. В большинстве случаев вместе с границей оказывались нарушены и соседние с ней участки генома.

Сейчас наши коллеги из Института цитологии и генетики СО РАН, имея подробную карту ТАДов человека, разрабатывают алгоритмы для предсказания клинических эффектов разных хромосомных перестроек. Они же пытаются узконаправленно нарушать границы ТАДов у мышей. Это почти инстинктивное стремление любого исследователя при виде нерушимой границы: а давайте мы ее снесем и поглядим, что выйдет.

Наши коллеги решили снести границу того самого ТАДа, где у мышей находится ген KIT. А KIT заинтересовал их своим соседом по геному – KDR. Если представить геном в виде линии, то эти два гена расположены близко, точно друг за другом. Однако в пространстве ядра они контактируют нечасто и заключены в отдельные ТАДы. Это позволяет им иметь независимую регуляцию – в конкретном типе клеток независимо друг от друга нарабатывать белки. В меланоцитах или тучных клетках (иммунных клетках, известных своей ролью в воспалении и аллергии) KIT активен, а его сосед KDR неактивен. И наоборот, например, в выстилающих сосуды эндотелиальных клетках KIT неактивен, а KDR активен. А что будет, если границу ТАДа между KIT и KDR сломать?

Для взлома границы наши коллеги использовали геномную технологию CRISPR/Cas9²⁸, которая в народе называется геномными ножницами.

При встрече с ДНК перед CRISPR/Cas9 стоит две задачи: найти целевой участок и разрезать. Комплекс CRISPR/Cas9 состоит из короткой направляющей РНК, комплементарной целевому району ДНК, который нужно изменить, и белка Cas9, который разрезает ДНК точно в том месте, где прилепилась направляющая РНК. Если нам нужно удалить ген целиком, мы нацелим одну направляющую РНК на его начало, а другую – на его конец. Cas9 внесет разрывы в оба эти места. Ген будет удален, а ферменты репарации заделают брешь в ДНК. Если нам нужно не удалить ген, а изменить его, например, заменить в нем один нуклеотид на другой, то одновременно с РНК-направляемым белком Cas9 мы добавим в комплекс CRISPR/Cas9 короткий фрагмент ДНК, в котором в правильном месте находится нужный нуклеотид. В этом случае ферменты репарации заделают брешь по той матрице, которую мы им предложим.

Наши коллеги секвенировали границу того самого ТАДа, где находится KIT, приготовили комплементарную ей направляющую РНК, а потом ввели ее в комплексе с белком Cas9 в оплодотворенные яйцеклетки мыши. Стали дожидаться рождения безграничных мышей.

Мы помним, как коллеги ликовали, когда у них родилась мышь с белым пятном на брюхе. Вот оно, ожидаемое событие, показывающее колоссальную важность ТАДов! Граница пала, в нужный ТАД влезли посторонние регуляторы и нарушили функцию нормального KIT!

Они эту белобрюхую мышь секвенировали и пришли в уныние. Оказалось, что они маленько промахнулись и вместе с забором снесли полдома – кусок гена KIT! То есть попали они именно туда, куда целились, но их подвела система репарации. Коряво заштопала разрывы и в итоге выкосила ген²⁹.

Но среди безграничных мышей родились и те, у которых удаление границы ТАДа произошло без сюрпризов от системы репарации. Выглядели они вполне нормально (хотя особо зоркие люди сумели отметить, что безграничные мыши имеют шоколадный, а не, как у их родителей, черный окрас), а изменения у них произошли на уровне отдельных клеток. В меланоцитах KDR смог проявить свою активность, перехватив регуляторы, которые раньше были спрятаны от него за забором, потому что принадлежат KIT, – завел контакты со своим соседом³⁰.

Пока наши коллеги взламывали границы между мышиными генами KIT и KDR, кошачья генетика не стояла на месте. Появилась статья³¹ о том, что рецессивная мутация w^sal, которая приводит к образованию больших белых пятен и общему осветлению шерсти, обусловлена делецией большого сегмента ДНК (65 тысяч нуклеотидов). Прелесть этой мутации в том, что она находится не в самом гене KIT, а перед ним, между генами KDR и KIT. Нам очень хочется думать, что эта делеция включала в себя границу двух ТАДов.