Коэффициент наследуемости как инструмент для анализа наследования количественных признаков вполне устраивал прежние поколения генетиков и селекционеров. За неимением лучшего инструмента. В XXI веке, когда чтение геномов стало рутинной, быстрой и относительно дешевой процедурой, в руках ученых, занимающихся генетикой количественных признаков, появился новый превосходный инструмент. Его называют полногеномным анализом ассоциаций (от англ. Genome-Wide Association Study, GWAS). Точка. Ассоциаций между чем и чем? Ассоциаций чего с чем? Ассоциаций между последовательностями нуклеотидов в отдельных районах генома и значениями признаков у их носителей.
С помощью этого анализа мы можем оценивать вклад в признак отдельных генов, находить их в геноме (картировать) и выяснять механизмы их действия. Как только мы картируем гены и поймем, как они работают, мы сможем предсказывать значения количественных признаков у потомков гораздо точнее, чем делали это раньше на основе коэффициента наследуемости и среднего значения признаков родителей.
Первое, что требуется для такого анализа, – это расставить сигнальные флажки по всему геному. Такими флажками служат ОдноНуклеотидные Полиморфизмы (ОНП). Так называют точки генома размером в один нуклеотид, в которых у разных особей в популяции могут находиться разные нуклеотиды (полиморфные нуклеотиды)[76]…
Миллионы таких ОНП найдены в геномах множества живых организмов. У человека их найдено около 300 миллионов. У кошки – поменьше, около 37 миллионов. Но по числу вариантов на душу населения каждый кот вдвое обгоняет своего хозяина – у него их в среднем около 10 миллионов против 4–5 миллионов хозяйских ОНП187.
ОНП выявляют полным секвенированием нескольких особей одного вида (например, котов). Затем из них выбирают несколько сотен тысяч ОНП – сигнальных флажков, относительно равномерно распределенных по всем хромосомам. Для этих ОНП изготавливают геномные чипы.
ДНК-чип – это набор лунок в пластиковой панели. К пластику этих лунок пришиты фрагменты ДНК размером около 25 пар нуклеотидов из того района, где обнаружена ОНП. Эти фрагменты различаются только одной точкой, ОНП, которая находится в самой середине фрагмента и представлена двумя вариантами: А или Г. Таких лунок в чипе от нескольких десятков тысяч до нескольких сотен тысяч. В исходной кошачьей панели было 63 тысячи лунок. Этого оказалось мало. В 2021 году люди уже работали с панелью на 340 тысяч лунок.
Как люди работают с чипами ДНК? Они выделяют ДНК из тканей. У кошек это обычно образцы крови, оставшиеся от рутинных анализов. Можно использовать выщипы (не состриги!) шерсти, но это хуже: там меньше ДНК. Выделенную ДНК расщепляют на мелкие фрагменты с использованием бактериальных ферментов, которые режут ДНК по определенным коротким последовательностям. Затем эти фрагменты копируют (реплицируют) в пробирке с использованием нуклеотидов, меченных флуоресцентными красителями.
А потом происходит самое интересное. Смесь фрагментов ДНК определенного кота наносят на панель. Фрагменты ДНК гибридизуются (химически склеиваются) с комплементарными им последовательностями на чипе. Сила склеивания зависит от степени комплементарности. Фрагменты из середины хромосомы А1 не гибридизуются с лункой, где приклеен фрагмент конца этой же хромосомы или любого другого района генома. С этой лункой гибридизуется только гомологичный ей фрагмент из генома нашего кота, причем наиболее сильно приклеится именно тот фрагмент, где совпадают средние нуклеотиды. Потом чип промывают, так что все случайно и слабо склеенные фрагменты смываются, а остаются только точно и сильно склеенные. Далее лазер регистрирует свечение каждого сегмента каждой лунки. Он показывает, что в лунке, соответствующей району ОНП, который находится на расстоянии 3 456 789 нуклеотидов от начала хромосомы А1 у кота по кличке Буцефал, светится сегмент А, а у его сестры, кошки по кличке Бургунди, – и сегмент А, и сегмент Г, а у их сродного брата Арго – только сегмент Г. Так мы узнаем генотипы наших котов по каждому из 340 тысяч районов генома. Только зачем нам это надо?
Давайте разберем это на конкретной работе исследователей из Корнельского университета188. При этом университете уже много лет работает ветеринарная клиника, через которую прошли тысячи кошек с разными диагнозами. Образцы ДНК и диагнозы 1122 кошек и послужили материалом для полногеномного анализа ассоциаций девяти распространенных кошачьих заболеваний. С использованием своего чипа на 340 тысяч ОНП исследователи генотипировали их всех.
Прежде всего, они проверили, как работает их система, ловит ли она известные ассоциации. Для этого ученые выбрали среди генотипированных животных 90 рыжих и 121 нерыжую кошку. Затем они определили, какие ОНП встречаются среди рыжих достоверно чаще, чем среди нерыжих. Как и ожидалось, рыжие достоверно отличались от нерыжих по 25 ОНП, локализованным на Х-хромосоме между 102 884 842 и 112 136 902 139 нуклеотидами от ее начала, в то время как по остальным ОНП они практически не различались.
Убедившись на этом опыте, что их система работает, исследователи перешли к поиску вариантов генов, связанных с болезнями. В их список входили самые распространенные кошачьи болезни: гипертрофическая кардиомиопатия, гипертиреоз, сахарный диабет, хроническая болезнь почек, хроническая энтеропатия и четыре другие. Подход использовали тот же: выбрали среди генотипированных животных группу больных и группу здоровых и искали ОНП, которые чаще встречались среди больных, чем среди здоровых. Так они обнаружили, что предрасположенность к диабету ассоциирована с районом вокруг нуклеотида 83 583 678 от начала хромосомы D4. Аллель А выявляли достоверно чаще у больных кошек (37%), чем у здоровых (17%).
Как видите, эта ассоциация не абсолютна. Далеко не все больные кошки имеют этот аллель, а у некоторых здоровых он тоже есть. Почему это так?
Потому что “ассоциированный” аллель чаще всего маркирует не сам ген, который вызывает болезнь, а район генома, где этот ген находится. Как правило, предрасположенность к заболеваниям контролируется многими генами, и найденный в обнаруженном нами районе ген предрасположенности не единственный, а один из множества. Так, кроме района вокруг 83 583 678 нуклеотида от начала хромосомы D4, значимые ассоциации с диабетом показали хромосомы A3, B1 и E1.
Что же за гены находятся в районах, которые оказались ассоциированными с диабетом? Район вокруг 83 583 678 нуклеотида от начала хромосомы D4 содержит много генов обонятельных рецепторов. Эти рецепторы кроме самих запахов определяют вкус и аппетит. Аллельные варианты, ассоциированные с диабетом, могут способствовать риску ожирения и следующего за ним диабета. Кроме того, было показано, что один из генов обонятельных рецепторов у мышей активен в клетках поджелудочной железы и регулирует секрецию инсулина. В ассоциированном районе хромосомы B1 находится ген меланокортина 4, мутации которого тоже приводят к ожирению.
Вот, кстати, еще одна причина, почему ассоциации районов хромосом с болезнями не стопроцентны. Гены контролируют не сами болезни, а предрасположенности к ним. У котов – носителей опасных аллелей могли быть разумные хозяева, которые держали своих питомцев на диете, предохраняя их от ожирения.
Полногеномный анализ ассоциаций позволяет картировать гены количественных признаков, таких, например, как рост, длина хвоста или особенности поведения. Пример такого анализа, который пока не провели, показан на рисунке 11–2. Генетики должны прогенотипировать тысячи кошек и измерить длины их хвостов. Затем они должны найти те районы генома, которые различаются у кошек разной хвостатости. В нашем умозрительном примере носители генотипа Г/Г – самые длиннохвостые, у гетерозигот Г/А хвосты в среднем чуть короче, а у гомозигот А/А – еще меньше (рис. 11–2). На нашем умозрительном рисунке мы сильно преувеличили различия в хвостах между генотипами. На самом деле (если мы не включаем в анализ бобтейлов и мэновских бесхвостых) даже самые сильные аллели вряд ли изменяют хвост больше, чем на несколько миллиметров.
Здесь мы вынуждены еще раз сказать, что полногеномный анализ ассоциаций не находит сами гены болезней и количественных признаков. Он только указывает на области генома, где их надо искать.
После того как район поиска очерчен, начинается его прочесывание мелким гребнем. Этот район секвенируют и определяют, что в нем находится. Если там находят гены (то есть последовательности, снабженные промоторами), то пытаются определить, что это за гены, чем аллели больных животных отличаются от аллелей здоровых животных, какие мутации чаще встречаются у короткохвостых котов по сравнению с длиннохвостыми. Где эти мутации – в интронах или в экзонах? Если в интронах, то где – где-то в середине или на краю, в точках сплайсинга? Если в экзонах, то в каких позициях кодонов: в первой, второй или третьей? Если за пределами генов, то нет ли там энхансеров, сайленсеров или каких-то других последовательностей, управляющих активностью генов? Какие белки могут связываться с этими последовательностями? Это только малая часть вопросов, которые пытается решить генетик, поймав достоверную ассоциацию между ОНП и признаком.
Рис. 11–2. Анализ ассоциаций между вариантами ОНП и количественным признаком.
Полногеномный анализ ассоциаций – это сейчас главный инструмент предиктивной медицины, нутригенетики и психологии. Давайте еще раз потренируемся на людях, посмотрим, как это работает.
Несколько лет назад Павел Бородин отдал свой драгоценный геном на анализ в четыре фирмы, которые специализируются на секвенировании и интерпретации человеческих геномов. Они его прочипировали[77] и выдали сотни интерпретаций. Рассмотрим две.
Бородину посулили никотиновую зависимость – “состояние патологического влечения к табаку (сигарет, сигар, сигарилл, курительных трубок или кальяна)”. Вероятность того, что у него есть никотиновая зависимость, они оценили в 56%. Это значит, что никотиновая зависимость была у 56 из 100 мужчин, клиентов этой фирмы в его возрасте и с похожими вариантами ОНП, ассоциированными с никотиновой зависимостью. По мнению исследователей, наибольшая вероятность развития этого пристрастия у него была в возрасте 29 лет. Она составляла 74%. Интересно, что, по их мнению, с возрастом она убывает, как за счет бросания курить, так и за счет вымирания курильщиков.
Тут они попали в точку. Павел Бородин приобрел эту зависимость в 20 лет и потом 40 лет курил как паровоз. Правда, уже 15 лет не курит. А теперь посмотрим научное обоснование этого прогноза. Они исследовали 7 ОНП в единственном районе хромосомы 8 – 3 в гене CHRNB3 (рецептора никотина) и 4 в межгенных областях возле него. Ранее на тысячах людей разных стран и народов была убедительно показана ассоциация этого района с никотиновой зависимостью, измеренной в числе сигарет, выкуриваемых за день. А у Бородина, который в свои лучшие годы с завидной регулярностью выкуривал по 20 сигарет в день, обнаружились те самые аллели.
Но со второй интерпретацией генодиагносты пролетели. Они утверждали, что он должен петь лучше, чем 75% клиентов их фирмы. Все его родные и знакомые удивлялись, где же генодиагносты нашли столько людей более безголосых, чем он, полностью (по мнению родных и знакомых) лишенный музыкального слуха.
Опять посмотрим научное обоснование. Оказывается, у него есть положительный аллель в гене UGT8, который активно работает в мозге. Откуда известно, что он положительный? Анализ ассоциаций между районом генома, где находится этот ген, и результатами теста на способность человека вокально воспроизводить музыкальные ноты, проведенный на монгольской популяции189, показал, что у особо музыкальных людей присутствует тот же аллель, что и у Павла Бородина. Так что теперь у Бородина есть научное доказательство того, что он поет очень хорошо, а его родные и знакомые ничего не понимают в искусстве.
Но, конечно же, его Кот поет гораздо лучше него. Да что там, коты поют гораздо лучше любого человеческого певца (или певицы) с любым генотипом по гену UGT8. Они – одни из самых музыкальных млекопитающих. Их диапазон превышает десять октав, им нет равных по силе и полетности голоса. Про тембр мы уж и не говорим. В зависимости от настроения и сезона он меняется от колоратурного до драматического. Для нас загадка, почему до сих пор никто не провел генетический анализ этого уникального кошачьего свойства. Наверное, потому, что признак уж очень сложный. Но лед тронулся. Генетики взялись за мурлыканье и коммуникативное мяуканье.
Одни кошки начинают мурлыкать от малейшего прикосновения, другие – только в особых случаях. Ученые выяснили, что причина таких различий может быть связана с числом повторенных последовательностей ДНК в гене андрогенового рецептора, который расположен на X-хромосоме190. Количество повторов варьирует у домашних кошек от 15 до 22. Исследование, проведенное на 280 стерилизованных беспородных кошках, показало удивительную закономерность: животные с короткой версией гена (18 и менее повторов) значительно чаще мурлыкают и мяукают по сравнению с обладателями длинной версии (19 и более повторов). Влияние генетических вариантов проявляется по-разному у самцов и самок. Коты с короткой версией гена андрогенового рецептора демонстрируют не только более активное мурлыканье, но и повышенную склонность к “разговорам” с людьми. У кошек же короткая версия гена помимо мурлыканья связана с большей агрессивностью к незнакомцам.
Полногеномный анализ ассоциаций позволил найти в геноме кошек районы, а потом и аллели, ответственные за внешние признаки и предрасположенности к нескольким десяткам наследственных болезней191. Эти знания служат основой для создания рутинных тест-систем, которые используются в вет-геномных лабораториях. Кошки здесь сильно отстают от собак по богатству тест-систем, но потихоньку их догоняют. Все это, конечно, радует сердца кошковладельцев, но есть одна проблема, о которой им следует помнить при интерпретации результатов анализов. Аллели предрасположенности к диабету у кошек породы серенгети могут быть совсем иными, чем выявленные у мейн-кунов. Более того, они, скорее всего, будут находиться в разных районах разных хромосом. Как аллели музыкальности у монголов и Павла Бородина.