В Бресте 5 октября собрались как униаты, так и православные. Униатов возглавлял митрополит Михаил Рогоза в сопровождении пяти епископов — Ипатия Поцея из Владимира-Волынского, Кирилла Терлецкого из Луцка, Германа из Полоцка, Ионы Гоголя из Пинска и Дионисия Збируйского из Холма. На их стороне были по крайней мере три архимандрита и несколько других представителей духовенства. Папа назначил на собор семерых представителей: Яна Димитра Соликовского, католического епископа Львова, католических епископов Луцка и Холма и четырех иезуитов, включая Петра Скаргу. Король направил на собор в качестве своих посланников трех католических вельмож: Николая Криштофа Радзивилла, Льва Сапегу и Димитра Халецкого. Их сопровождало большое количество знати и слуг.

Во главе православной делегации были экзархи: патриарха Константинопольского — Никифор и патриарха Александрийского — Кирилл Лукарис, а также два настоятеля монастырей с горы Афон. В нее входили только два западнорусских епископа: Гедеон Балабан из Львова и Михаил Копыстинский из Перемышля. Их поддерживали девять западнорусских архимандритов, два настоятеля и не менее ста священников.

Православными мирянами руководил князь Константин Острожский. С ним был его сын Александр (воевода из Волыни) и несколько вельмож — главным образом волынская знать. Кроме того, было много мирян, представлявших области и районы Вильно, Киева, Галиции, Волыни, Браслава, Перемышля и Пинска; города Вильно, Львов, Пинск, Вельск, Брест, Каменец-Подольский, Киев, Владимир-Волынский, Минск, Слуцк и ряд других; были, наконец, представители от православных братств Вильно и Львова. Ради предосторожности князь Острожский и другие православные вельможи прибыли с вооруженными отрядами и даже прихватили пушки.

Накануне открытия собора экзархи восточных патриархов и князь Острожский предложили митрополиту Михаилу Рогозе встретиться, чтобы определить вопросы, которые будут обсуждаться. Митрополит не дал определенного ответа, но 6 октября созвал всех униатских делегатов в брестский кафедральный собор на молитву и зарегистрировал этот акт через государственного нотариуса Бреста как официальное открытие собора.

Православные не были приглашены в собор — более того, по приказу Ипатия Поцея все русские церкви в Бресте на время собора закрыли. Православные собрались в частном доме, принадлежавшем боярину Райскому, где был большой зал, который служил протестантской часовней. Здесь православные провели весь день в неизвестности, ожидая ответа от митрополита Михаила, а не дождавшись, решили провести свой собственный собор, разделившись на два «кола» — из священников и мирян.

Таким образом, вместо единого церковного собора в Бресте было организовано два — униатский и православный. 8 октября православный собор заявил о том, что вопрос об унии с Римом не может быть решен одной только западнорусской церковью, а лишь по соглашению с восточными патриархами и со всеми православными церквями. После этого Петр Скарга прислал православным требование королевских представителей направить на униатский собор депутатов, чтобы выслушать королевские приказы, и добился приватной беседы с князем Константином Острожским. На князя доводы Скарги действия не возымели. Что же до православных депутатов, то королевские представители безуспешно убеждали их принять унию.

9 октября униатский собор торжественно провозгласил унию западнорусской церкви с Римом и отлучил от церкви епископа Гедеона Балабана и всех православных монахов и священников, которые унию принять отказались. В тот же день православный собор объявил об отказе принять унию, а экзарх патриарха Никифор лишил униатского митрополита и епископов сана и права проводить церковные службы.

Оба собора обратились с петициями к королю, и каждый просил его утвердить соответствующие решения. Конечно же, король определил свою позицию уже давно: он утвердил права и привилегии униатской церкви как единственно законной церкви русского населения Польши и Литвы. Следом за этим Никифора обвинили в том, что он турецкий шпион. Экзарх предстал перед судом, и, хотя был оправдан, его, по приказу короля, заключили в Мариенбургский замок, где уморили голодом.

Как представители единственной теперь законной западнорусской церкви, униаты потребовали отдать им все церковные здания и земельные угодья православных. Без особого труда им удалось завладеть многими православными монастырями. Натиск униатов еще более усилился в 1599 году, когда умер первый униатский митрополит Михаил Рогоза и на его место сел Ипатий Поцей. Православные оставались хоть как-то защищены лишь в тех городах и районах, которые находились под властью князя Константина Острожского и других — теперь уже немногочисленных — православных вельмож. В 1599 году православные заключили соглашение с протестантами о совместной защите прав религиозных инакомыслящих.

После принятия Брестской унии многие западнорусские дворяне либо присоединились к униатской церкви, либо раз и навсегда были обращены в католицизм. Однако среди городского населения, особенно среди крестьян, долгое время продолжалось упорное сопротивление унии.

На протяжении всего XVII века большинство украинских крестьян сохраняли свою традиционную веру, и давление униатов вызывало их сильное возмущение. Таким образом, организация униатской церкви не привела к принятию украинскими крестьянами польского режима. Введение унии фактически разделило западнорусскую церковь на две части: на униатскую церковь и православную церковь. Уния сеяла раздор и этим порождала раздражение. Она придала религиозный характер социальным разногласиям крестьян и казаков, которые постепенно стали поборниками православия.