После того как Джонас Солк в 1950-х гг. создал первую эффективную вакцину против полиомиелита, он получил возможность построить исследовательский центр своей мечты на 11 гектарах океанского побережья в калифорнийской Ла-Холье. Солк попросил архитектора Луиса Кана создать что-то «достойное визита Пикассо». Получившееся в результате сооружение из тикового дерева и бетонных блоков сегодня известно как шедевр архитектуры и оплот передовой науки. Но мало кто понимает, что Институт биологических исследований Солка, названный в честь человека, чья вакцина уберегла мир от одной пандемии, стал также местом зарождения идеи мРНК-вакцин, с помощью которых спустя много лет удалось взять под контроль другую пандемию. Этот факт остается незамеченным, поскольку путь от революционной идеи до ее спасительного воплощения содержал больше изгибов и поворотов, чем скалистая береговая линия в том месте, где стоит институт.
В 1989 г. Боб Мэлоун, бывший тогда аспирантом, работал в Институте Солка в лаборатории Индера Вермы, специалиста по введению генов в человеческие клетки с помощью вирусов. Эта технология легла в основу зарождавшейся новой области – генной терапии, где ДНК используется для лечения или профилактики заболеваний. Чаще всего для этого человеку вводят новую копию здорового гена, чтобы компенсировать влияние гена дефектного. Очевидно, что этим способом можно было лечить такие заболевания, как серповидноклеточная анемия, мышечная дистрофия и муковисцидоз, где мутировавший ген был хорошо известен. Поскольку генная терапия могла обеспечить стойкое выздоровление при таких заболеваниях, она в то время была актуальной темой в университетах и компаниях поблизости от Сан-Диего.
Помимо генной терапии, ученые в то же самое время работали над смежной темой ДНК-вакцин. Эти два подхода объединены общей идеей: вместо того чтобы вводить человеку полезный белок, можно пойти напрямик и ввести ген для синтеза этого белка, чтобы клетки сами копировали информацию с ДНК в виде мРНК, а потом на основе этой информации вырабатывали белок. Но если задача генной терапии – изменить геном человека навсегда, то в случае с ДНК-вакцинами даже временной выработки вирусного или бактериального белка может быть достаточно, чтобы иммунная система человека научилась распознавать незваных гостей.
В 1980-х гг. ученые были воодушевлены возможностями ДНК-терапии, но работавший в Институте Солка Боб Мэлоун увидел главный потенциальный недостаток этого метода. Когда людям вводили ДНК, невозможно было предсказать, куда именно в геноме она встроится. Возьмем для сравнения гаечный ключ – изначально полезный инструмент, хорошо подходящий для закручивания гайки на болте. А теперь представьте, что этот гаечный ключ бросили куда-то в автомобиль. Он может попасть туда, где это не опасно, – на пол, на подушку сиденья, в багажник, бардачок или на приборную панель. Но если он застрял где-то внутри двигателя, колесного диска, амортизатора или карданного вала, то может помешать работе автомобиля. А если гаечный ключ попадет под педаль тормоза или на педаль газа, автомобиль может выйти из-под контроля. Аналогичные опасения возникают и в отношении ДНК-терапии. Если ДНК, несущая посторонний ген, случайным образом встраивается в геном пациента, она может оказаться в части хромосомы, не служащей переносчиком важной информации, и тогда не причинит вреда. Но если по роковой случайности она прервет работу здорового гена или запустит экспрессию гена, стимулирующего деление клеток, это может вызвать заболевание, в частности онкологическое. И действительно, несколько лет спустя обрела широкую известность история, когда у ребенка, получавшего генную терапию при лечении тяжелого комбинированного иммунодефицита – «синдрома мальчика в пузыре», развилась лейкемия: введенная ДНК случайно попала в хромосому рядом с геном, стимулирующим рост клеток, и включила его активность.
Мэлоун и Верма поняли, что проблемы можно избежать, если инструкции по производству белка вводить в организм в виде мРНК, а не ДНК. Ведь мРНК не встраивается в ДНК больного, таким образом, исключается возможность постоянных нежелательных изменений. Спустя 30 лет эта некогда мало кому известная идея получила воплощение и широкое распространение в виде мРНК-вакцин.
Даже по самым скромным подсчетам, мРНК-вакцины спасли миллионы жизней в борьбе с COVID–19. Сейчас такие препараты разрабатывают не только против других вирусов (от респираторно-синцитиального вируса до обычной простуды), но и против опухолей. Хотя будущее мРНК-вакцин кажется блестящим и, возможно, они даже произведут революцию в медицине, история их разработки остается туманной и не совсем понятной. Как всегда в вопросах здравоохранения, отсутствие четкой информации привело к путанице и создало благоприятную почву для теорий заговора.
Помню, как весной 2020 г. мРНК-вакцины впервые попали в газетные заголовки. Репортеры и пользователи социальных сетей обсуждали мРНК так, словно это какое-то чужеродное вещество, новый препарат. Многие не понимали, что, хотя мРНК действительно лишь недавно стала использоваться в качестве вакцины, это естественная и важная часть каждой клетки нашего организма и каждой клетки любого другого организма на Земле. Из-за отсутствия знаний об РНК вспыхнули опасения, что мРНК-вакцины – нечто однозначно опасное.
Однако не только отсутствие знаний о природе мРНК способствовало подозрительному отношению к таким вакцинам. Еще одним фактором была молниеносная скорость их появления. Поражал тот факт, что безопасные и эффективные мРНК-вакцины были предложены, изготовлены, проверены и одобрены для экстренного применения всего за год, тогда как обычно на разработку вакцин требуется от шести до восьми лет.
Как ученым удалось так быстро это сделать? Если коротко, то никак. Хотя вакцина от COVID–19 создавалась в рекордные сроки, в ее основу легли научные открытия, сделанные на протяжении десятилетий. Представьте себе, что вакцина – это пазл. То, как быстро он был собран, впечатляет, но все кусочки уже лежали на столе, когда разразилась пандемия. Сложность заключалась в том, чтобы понять, как их соединить вместе. А в качестве дополнения к собранному пазлу стало ясно, что полученные знания можно использовать для разработки мРНК-вакцин против новых вирусов и других опасных для жизни заболеваний.
Первое, что необходимо для создания мРНК-вакцины, особенно такой, которая предназначена для иммунизации значительной части 8-миллиардного населения планеты, – это возможность синтезировать мРНК в нужных количествах, в идеале вагонами. Один трудолюбивый биохимик, Билл Стьюдер, нашел этот первый важный фрагмент головоломки еще в начале 1980-х гг.
Стьюдер родился в 1936 г. и вырос в Уэверли, маленьком городке Айовы. Он учился в Йельском университете, затем защитил диссертацию в Калифорнийском технологическом институте и был в постдокторантуре Стэнфорда. В 1964 г. он работал в Брукхейвенской национальной лаборатории на Лонг-Айленде (штат Нью-Йорк), возглавляя исследовательскую группу, изучавшую бактериофаг Т7 – вирус, который поражает кишечную палочку.
Брукхейвенская национальная лаборатория унаследовала здание военной базы Аптон, которая была закрыта после Второй мировой войны, и превратила его в исследовательский центр по разработкам методов мирного использования атомной энергии. В лаборатории имелся также биологический отдел, где Стьюдер получил возможность изучать то, что ему было интересно, без оглядки на коммерческое или медицинское применение. Фаг Т7 был именно такой темой. Как может ДНК-вирус, заражающий бактерии, иметь какое-то отношение к медицине?
Стьюдер был очарован невероятной эффективностью, с которой Т7 использовал бактерию для собственных нужд, превратив незадачливую клетку в фабрику по производству новых фагов. Ученый выяснил, что сначала фаг захватывал принадлежащий кишечной палочке механизм копирования ДНК в виде РНК, а именно – в РНК-полимеразу, и использовал ее для создания копий собственной РНК-полимеразы. Как только РНК-полимераза фага была сделана, она не тратила усилия на гены кишечной палочки, а была настроена на копирование только генов фага и образовывала мРНК для создания белков фага. Такой исключительной специфичностью фаговая полимераза обладала потому, что работала только там, где была определенная последовательность из 17 пар оснований ДНК, – это так называемый сайт инициации, расположенный в начале каждого гена фага. Таким образом, полимераза могла полностью игнорировать все соседние бактериальные гены, у которых не было такого сайта. Короче говоря, РНК-полимераза фага Т7 была сверхпродуктивной машиной для синтеза РНК.
РНК-полимеразу фага Т7 можно использовать для транскрипции практически любой требуемой РНК. Ученый добавляет сайт инициации Т7, состоящий из 17 пар оснований, перед геном, который нужно скопировать. Затем полимеразы собирают мРНК из нуклеотидных строительных блоков (здесь изображены две полимеразы, идущие слева направо). На последнем показанном этапе рибосомы считывают информацию с мРНК и синтезируют белки. Например, рибосомы в клетке вакцинированного человека используют введенную мРНК для синтеза шиповидного белка коронавируса
Еще в 1981 г. Стьюдер предсказал, что Т7 РНК-полимеразу можно перенаправить на синтез мРНК, кодирующей любой нужный белок[248]. Вскоре они с коллегой Джоном Данном воплотили это предположение в реальность. Им удалось выделить ген фага Т7, кодирующий РНК-полимеразу Т7[249]. Затем они встроили этот ген в кишечную палочку, так что почти вся бактериальная клетка заполнилась РНК-полимеразой Т7, которую они потом легко смогли очистить. От внимания Стьюдера и Данна не ускользнуло, что Т7 РНК-полимеразу можно использовать в лаборатории для производства определенных РНК и синтеза нужных белков внутри клеток[250]. То, что этим белком окажется шиповидный белок коронавируса, никому из них тогда в голову прийти не могло.
Следующим кусочком пазла, необходимым для создания мРНК-вакцины, был способ доставки – следовало помочь мРНК проскользнуть в клетку человека сквозь защитную оболочку. Как мы уже видели на примере миРНК-препаратов, РНК трудно проникнуть через липидные мембраны, защищающие клетку. Фил Фелгнер первым понял, что липидные оболочки не только осложняют попадание нуклеиновых кислот внутрь клетки, но и способны помочь решению этой проблемы. Он был убежден, что, если РНК-вирусы умеют проникать в человеческие клетки, значит, можно покрыть мРНК-лекарство липидной оболочкой, как у вируса, и преодолеть таким образом трудности доставки.
Возможно, столь креативное решение было найдено благодаря артистическому темпераменту Фила. Прежде чем сделать научную карьеру, он жил в Сан-Франциско, учился играть на классической испанской гитаре и выступал в кафе[251]. Закончив постдокторантуру в штате Вирджиния, он вернулся в район Залива в Сан-Франциско, устроился в корпорацию Syntex и начал разрабатывать липидные средства доставки мРНК.
К счастью, Фил оказался достаточно смелым, чтобы сделать ставку на липиды. Об этих жирных маслянистых молекулах большинство исследователей РНК и ДНК обычно стараются даже не вспоминать. РНК и ДНК ведут себя хорошо – их легко выделить в чистом виде и легко растворить в воде. Липиды же представляют собой обширную группу ускользающих молекул, которые плохо растворимы в воде, но любят собираться вместе с другими липидами. Миллион липидных молекул образует нечто похожее на уличную толпу в Буэнос-Айресе после победы Аргентины на чемпионате мира в 2022 г. – скопление тесно прижатых друг к другу тел, когда при этом отдельные люди перемещаются в массе, так что их положение каждую минуту меняется. Точно так же липиды плотно прилегают друг к другу, образуя мембрану, которая окружает и защищает клетку или обернутый ею вирус.
Во время работы в Syntex Фил понял, насколько сложно создать липидные средства доставки нуклеиновых кислот. Большинство липидов в естественных биологических мембранах заряжено отрицательно, так же как нуклеиновые кислоты ДНК и РНК, а следовательно, они отталкивают друг друга. Поэтому Фил попытался синтезировать положительно заряженные липиды для упаковки нуклеиновых кислот. Теперь они легко прилипали к нуклеиновым кислотам, но оказалось, что столь же легко они прилипают к любым попавшимся им клеточным мембранам, а это нехорошо, ведь ему надо было сделать вирусоподобную упаковку, которая циркулировала бы внутри организма. Но Фил не сдавался и в конце концов придумал, как получить положительно заряженные липиды, формирующие маленькие контейнеры липосомы с нуклеиновыми кислотами внутри[252].
Прогресс, которого добился Фил, работая в Syntex, был сведен на нет в 1988 г., когда его начальник сообщил, что липидный проект закрывается, поскольку он не сулит компании прибыли в ближайшей перспективе. В Syntex предположили, что технология больше подходит для отдаленного будущего – не раньше года 2020-го[253]. (Этот дикий прогноз оказался пророческим, поскольку вакцина против COVID–19, состоящая из упакованной в липидную оболочку мРНК, была одобрена Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов именно на третьей неделе декабря 2020 г.[254]) Фил, продолжавший интересоваться доставкой нуклеиновых кислот с помощью липидов, переместился на юг и основал в Сан-Диего корпорацию Vical. И вскоре с ним связались Боб Мэлоун и Индер Верма из Института Солка.
Использование мРНК в качестве лекарства или вакцины позволит избежать одной из опасностей ДНК-терапии: ведь РНК не вносит необратимые и потенциально опасные изменения в геном. Рассуждая так, Мэлоун и Верма были совершенно правы. Но они также понимали, что у мРНК есть свои недостатки, и в частности она уязвима перед присутствующими в организме и вездесущими рибонуклеазами – ферментами, разрушающими РНК, а еще она с трудом проникает в клетки. В итоге пришли к выводу, что новые липосомы Фила могли бы решить обе проблемы, поэтому все три исследователя начали сотрудничать.
Для первых экспериментов группа из Института Солка выбрала мРНК, кодирующую белок люциферазу светлячков, – не потому, что он имел какое-либо терапевтическое значение, а потому, что его было так же легко обнаружить, как огоньки светлячков в летнюю ночь. Содержащий РНК липосомный препарат смешали с растущими в чашках Петри культурами клеток разных видов – человека, мыши, крысы, лягушки и мушки дрозофилы. Когда клетки начинали светиться, как миниатюрные светлячки, было ясно, что мРНК попала внутрь клеток и с нее начался синтез белка[255]. Таким образом, к 1989 г. ученые убедительно доказали, что мРНК можно использовать, чтобы перепрограммировать клетки на производство чужеродного белка.
Далее надо было проверить, сработает ли это на живом организме, а не только в чашке Петри. В следующем году Боб Мэлоун и Фил Фелгнер вместе с Джоном Вольфом из Висконсинского университета провели эксперименты с введением мРНК люциферазы в мышцы мышам[256]. Вся мышь не светилась в темноте, но светились мышечные клетки рядом с местом инъекции. Это экспериментально доказывало, что чужеродные мРНК могут управлять синтезом соответствующего белка в организме млекопитающего. Но люди, интересующиеся медицинским применением результатов опытов, все еще были настроены скептично. Конечно, ткань, куда вводили мРНК, светилась, но в существенной мере это мог быть эффект люциферазы светлячков, поэтому оставалось непонятным, сколько именно белка синтезируется с помощью чужеродной мРНК. Многие сомневались, что с доставленной в липидной капле мРНК можно получить достаточное количество белка.
Скепсис сохранился, несмотря на дальнейшие исследования двух специалистов по производству вакцин во Франции. В 1991 г. Пьер Мельен и Фредерик Мартинон присоединились к ведущей компании по производству вакцин Pasteur-Mérieux. Эта легендарная организация, расположенная в сельской местности неподалеку от Лиона, производила вакцины из ослабленных версий инфекционных вирусов. Ими могли быть «вакцинные штаммы» вирусов – специально полученные вирусы с нарушенной репликацией либо вирусы, которые были подвергнуты тепловому или химическому воздействию и в итоге утратили бо́льшую часть своих репликативных способностей. Метод может показаться довольно примитивным, но часто работает: на поверхности поврежденного вируса остаются белки, которые иммунная система использует в качестве инструкции, чтобы подготовиться к настоящей вирусной атаке. Фактически большинство используемых на сегодняшний день вакцин производится именно такими способами.
Размышляя так же, как Мэлоун и Верма, Мельен и Мартинон решили, что гораздо эффективнее будет вакцинировать нуклеиновой кислотой, и пусть организм человека сам выполнит работу по расшифровке информации из нее для синтеза вирусного белка. Но какую нуклеиновую кислоту лучше использовать для вакцины – ДНК или РНК? Немного пугало, что РНК сложно производить и сделать стабильной, однако Мельен и Мартинон были воодушевлены успехами Мэлоуна и Вермы. Для них решающим фактором при выборе стала безопасность: чужеродная ДНК может встроиться в хромосому человека с непредсказуемыми последствиями, а РНК не встраивается в хромосомы, РНК может некоторое время руководить синтезом белков и затем будет вычищена клеточным ферментом рибонуклеазой[257].
Мельен и Мартинон хотели использовать мРНК для получения вакцины против гриппа. В целях предварительной проверки они синтезировали мРНК, кодирующую белок вируса гриппа, поместили мРНК в липосомы и подкожно ввели мышам полученную смесь. Вскоре они с восторгом обнаружили, что у многих мышей после инъекции выработались зрелые лимфоциты Т-киллеры[258], нацеленные на те клетки мыши, которые были заражены вирусом гриппа[259]. Когда эти Т-клетки обнаруживают клетку, зараженную определенным вирусом, они буквально проделывают в ней дыры и уничтожают ее. Важно, что Т-киллеры могут обеспечить долговременную защиту от вируса, сроком от нескольких месяцев до нескольких лет, в зависимости от конкретного вируса. Однако работы Мельена и Мартинона были встречены без энтузиазма как научным сообществом, так и потенциальными инвесторами, которые по-прежнему считали, что РНК слишком нестабильна и будущее за ДНК-вакцинами[260].
Хотя изобретенные Филом Фелгнером липидные частицы работали в культуре клеток, в экспериментах на животных липиды создавали некоторые проблемы[261], в частности вызывали значительное сокращение белых клеток крови, борющихся с болезнями, осложнения со свертываемостью крови и сильное воспаление. Ученые предположили, что эти побочные реакции возникли из-за того, что липиды имеют положительный заряд (поскольку в природе положительно заряженные липиды не встречаются). Нужны были липиды нового поколения, с другим строением. И в итоге они появились благодаря Питеру Куллису из Университета Британской Колумбии в Ванкувере и компаниям, которые он основал.
Поперечный разрез липидной наночастицы (ЛНЧ), размером сопоставимой с коронавирусом. Каждый липид имеет положительно заряженную головную часть (маленький кружок), которая связывается с мРНК, и два жирных «хвоста», которыми липиды поворачиваются друг к другу. В действительности для изготовления ЛНЧ используют смесь липидов, а не один их тип, как показано здесь для простоты. Каждая ЛНЧ содержит несколько молекул мРНК для вакцинации (темные нити)
Эти новые липиды впервые были разработаны в 1990 г. Они обладают свойством менять свой электрический заряд в зависимости от кислотности среды. В слабокислом растворе, который получается, например, при добавлении уксуса или лимонного сока, они несут положительный заряд – идеально для связывания и упаковывания отрицательно заряженной РНК в мельчайшие сверточки, которые назвали липидными наночастицами (ЛНЧ). Когда исследователь нейтрализует кислотность раствора, электрический заряд липидов исчезает. Отсутствие заряда помогает наночастице циркулировать по кровотоку, прилипать к поверхности клетки и проникать внутрь. Как только упаковка попадает внутрь нужной клетки, из-за более кислой среды заряд липидов вновь меняется на положительный. Важно, что липиды с внутренней стороны клетки заряжены отрицательно. Теперь отрицательный заряд притягивается к положительному, мембрана становится жидкой и разрушается, а ее РНК-груз высвобождается в цитоплазму клетки[262].
В 2018 г. успешно завершились первые клинические испытания лечения транстиретинового семейного амилоидоза, при которых основанная Томом Тушлем и Филом Шарпом компания Alnylam использовала разработанные Куллисом липидные наночастицы для доставки миРНК, разрушающих мРНК. Как оказалось, это было генеральной репетицией перед доставкой мРНК несколькими годами позже.
Даже при использовании подходящего средства доставки с помощью липидных наночастиц мРНК-вакцине все равно нужно было обойти защитный механизм, который называется врожденным иммунитетом. Как мы уже знаем, вирусы, вероятно, появились так же давно, как и организмы, на которых они нападают, поэтому у эволюции было достаточно времени, чтобы выработать противовирусные стратегии. Одна из них, врожденный иммунитет, встречается у всех животных, от червей и насекомых до мышей и людей. Он «врожденный», потому что не зависит от предшествующего знакомства с патогеном. (Приобретенный иммунитет, в котором участвуют антитела и Т-клетки, напротив, гораздо более специфичен, и для него требуется предварительное знакомство.) Врожденная иммунная система распознаёт вирусную РНК, ориентируясь на отличия от нормальной человеческой РНК[263]. Например, промежуточные продукты репликации вирусной РНК двуцепочечные, потому что на основе плюс-цепи формируется минус-цепь, и наоборот. Длинные двуцепочечные РНК редко встречаются в неинфицированных клетках. Кроме того, вирусные РНК содержат обычные А, Г, Ц и У, тогда как клеточные РНК украшены различными нуклеотидными модификациями – к некоторым основаниям дополнительно прицеплены небольшие химические группы.
Благодаря распознаванию отличительных признаков вирусной РНК врожденная иммунная система день за днем обеспечивает нам противовирусную защиту, но это может помешать РНК-вакцинам. Тот же самый врожденный иммунный ответ, который запускается на вирусные РНК как на чужеродные, может реагировать как на чужеродные и на мРНК-вакцины, а в результате возникнет неприятная воспалительная реакция, сопровождающаяся сыпью, лихорадкой, головной болью и болью в суставах[264]. Не удивительно, что врожденному иммунитету трудно разобраться, намерена пришедшая РНК принести пользу или она замыслила что-то коварное. Поэтому еще одним ключевым элементом головоломки стала маскировка РНК: ее нужно было сделать непохожей на вирусную. И тут появляется Каталин (Кати) Карико.
Карико родилась в Венгрии в 1955 г., она увлеклась биохимией в пятилетнем возрасте, когда увидела, как мама варит мыло из животного жира и щелока. Но после защиты диссертации Карико поняла, как мало возможностей для научных исследований в коммунистической Венгрии. Поэтому в 1985 г. она вместе с мужем и двухлетней дочерью сбежала в США. Те небольшие деньги, которые у них были, она зашила в плюшевого мишку своей дочки[265].
К 1990 г. Карико была преподавателем в Пенсильванском университете. Она увлеклась разработкой лекарственных средств на основе мРНК. Но агентствам, выдающим государственные гранты, ее идея казалась нереалистичной. «Каждую ночь я работала: грант, грант, грант. И [в ответ] всегда приходило: нет, нет, нет»[266]. Цель показалась нереалистичной и ее университетскому руководству, и в 1995 г. Карико понизили в должности.
Затем, три года спустя, возле копировального аппарата произошел счастливый случай. До появления электронной подписки на журналы ученые делали ксерокопии статей из библиотечных журналов, чтобы почитать вечерком. Карико часто соперничала с новым преподавателем Дрю Вайсманом за доступ к ксероксу. После того как они столкнулись несколько раз, каждый из них понял, какие статьи копирует другой, и стало очевидно, что их интересы совпадают[267].
Вайсман был иммунологом и искал способ улучшения вакцины для людей. Карико была ученым, специалистом по РНК, убежденным, что возможность получать белки в терапевтических целях, используя мРНК, недооценивается. Они дополняли друг друга не только по научным интересам, но и по характеру. Карико была разговорчивой и энергичной, а Вайсман – более сдержанным и методичным[268].
Они вместе придумали, как замаскировать мРНК, чтобы врожденная иммунная система не сочла ее вирусной. Они обнаружили, что буква У в алфавите РНК – основной признак, по которому иммунная система распознаёт РНК, вероятно, потому, что это единственная буква, которая есть в РНК, но отсутствует в ДНК. Поэтому в 2005 г. Карико и Вайсман попробовали заменить все буквы У в мРНК различными модифицированными версиями У и обнаружили, что некоторые из модифицированных версий, в том числе та, которая называется псевдоуридин, в значительной степени игнорируются врожденной иммунной системой[269].
Важно отметить, что РНК-полимераза Т7, которую Билл Стьюдер изначально использовал для научных исследований, благополучно приняла этот модифицированный У и включила его в нужные участки растущей РНК-цепи. Рибосома тоже его приняла, прочитав как обычный У. Более того, синтез белка оказался даже более эффективным, когда мРНК содержала псевдоуридин. И даже сверх того: клеточные рибонуклеазы, так же как иммунная система, с трудом распознавали РНК с псевдоуридином, поэтому модифицированная РНК оказалась более стабильной, чем естественная[270]. Казалось, все слишком хорошо, чтобы быть правдой: две функции, которые необходимо было сохранить, – транскрипция и трансляция – при использовании псевдоуридина сохранялись или улучшались[271], тогда как два нежелательных эффекта – активация врожденного иммунитета и расщепление – подавлялись.
Среди компаний, получивших лицензию на использование технологии, предложенной Карико и Вайсманом[272], были BioNTech и Moderna. Изначально эти биотехнологические компании собирались применить ее для борьбы с раком. Но ничто так не меняет ваши планы, как потрясшая весь мир пандемия.
10 января 2020 г. профессор Юн-Чжэнь Чжан из Фуданьского университета в Шанхае разместил последовательность РНК нового коронавируса на сайте со свободным доступом[273]. Важность этого ориентированного на общественное благо поступка оценили не сразу, поскольку тогда за пределами Китая новый вирус вызывал лишь небольшие опасения. Да, он был родственен коронавирусам, повлекшим две предыдущие вспышки тяжелого острого респираторного синдрома – SARS в 2002 г. и MERS в 2012 г., но каждую из них удалось сдержать, и в результате от них в мире погибло менее 1000 человек. Однако у нового коронавируса, вскоре получившего название SARS-CoV–2, была другая судьба. Он оказался бедствием для планеты.
По какой-то причине ученые из тогда еще малоизвестной биотехнологической компании Moderna, расположенной в Кембридже (штат Массачусетс), в том же месяце поняли, что новый коронавирус представляет собой бо́льшую угрозу, чем SARS или MERS[274]. Ученые из столь же малоизвестной компании BioNTech в немецком городе Майнце тоже читали сообщения о новых случаях заражения в Ухане и увидели признаки зарождающейся пандемии: множество инфицированных, наличие бессимптомных носителей, которые могли невольно распространять вирус, и никаких попыток ограничить перемещение, чтобы сдержать вспышку[275]. Обе компании занимались разработкой лекарственных препаратов на основе матричной РНК. И обе компании поняли, что технологию мРНК, которую они используют, можно быстро перенастроить на создание белка, способного послужить вакциной против нового коронавируса.
Во многих отношениях эти компании сделали очень смелый шаг, учитывая, что на тот момент не существовало доказательств полезности хоть какой-нибудь мРНК-вакцины. Но все необходимые детали головоломки лежали перед ними на столе. В течение шести десятилетий ученые раскрывали тайны мРНК. Они расшифровали генетический код, поэтому любой мог прочитать определенную Юн-Чжэнь Чжаном последовательность SARS-CoV–2 и понять, как делать шиповидный белок. Они показали, что с помощью мРНК можно произвести достаточное количество белка, чтобы вызвать иммунный ответ, а это необходимо при разработке вакцины. Они разработали мощные технологии, позволяющие на основе ДНК сделать очень много РНК. Они узнали, что для введения РНК в клетку человека можно использовать сочетание липидов с РНК, и изобрели крошечные жировые шарики – липидные наночастицы. А еще они обнаружили, что основание У в мРНК можно заменять на модифицированный вариант, чтобы замаскировать мРНК и не вызывать нездоровой воспалительной реакции.
И все-таки любому, кто собирал пазл, известно, что после того, как на столе разложены все кусочки, начинается тяжелая работа. Чтобы понять, насколько сложно было создать эффективную вакцину от COVID–19, вспомним, что в гонке наряду с изобретателями мРНК-вакцин участвовало более десятка других соперников и многие из них использовали проверенные технологии[276], которые, казалось, с большой вероятностью сработают и здесь. Многочисленные участники состязания практиковали самые разнообразные подходы. Одни взяли инактивированные вирусы SARS-CoV–2, другие искусственно создали менее опасный вирус для выработки белка шипа, третьи предложили ДНК-вакцины. Некоторые методики в итоге привели к получению вполне достойных вакцин, как, например, ДНК-вакцина Oxford-AstraZeneca[277], первоначально использовавшаяся в Великобритании. Однако они не достигали такой эффективности, которая была у двух мРНК-вакцин. Ряд вариантов не вызвал достаточно сильного иммунного ответа, и в итоге образцы были отброшены.
Чтобы сложить весь пазл и создать мРНК-вакцину, требовались недюжинный талант, творческий подход, выдержка, а также поистине выдающиеся ученые. Среди них особенно интересны истории Угура Шахина и Озлем Тюреджи. Родившийся в Турции Угур Шахин переехал в Германию, когда его отец получил работу на автомобильном заводе Ford в Кельне. У Озлем Тюреджи тоже турецкое происхождение; ее мать – биолог, отец – хирург, оба иммигрировали из Турции в Германию. Шахин и Тюреджи познакомились в 2001 г., когда оба работали врачами в больнице германской земли Саар. Они поженились в 2002 г., и у них родилась дочь. Помимо семейных забот и радостей, их объединяет профессиональная страсть: они жаждут использовать новые научные достижения в областях, где ощутимы неудовлетворенные медицинские потребности, в частности в иммуноонкологии, которая занимается стимуляцией иммунной системы для распознавания и уничтожения опухолевых клеток.
В 2008 г. Шахин и Тюреджи основали компанию BioNTech с целью разрабатывать вакцины от злокачественных образований на основе мРНК (подробнее об этом чуть дальше). Работа была сложной, но в течение следующего десятилетия они достигли прогресса: шли клинические испытания более десятка соединений, и в январе 2020 г. наступил тот судьбоносный день, когда они приступили к новой задаче.
Мишенью для вакцины от COVID–19 должны были быть выдающиеся шиповидные выросты, которые придают коронавирусу его короноподобный вид. 90 выростов, образованные шиповидным белком[278], выступающие из липидной оболочки, окружающей коронавирус, – это первое, с чем сталкивается иммунная система, когда узнает о готовящейся атаке коронавируса. Поэтому стимуляции иммунной системы шиповидным белком должно быть достаточно, чтобы иммунная система сразу же распознала настоящий вирус. Кроме того, поскольку белок шипа помогает вирусу проникать в человеческие клетки, антитела, которые будут с ним связываться и облеплять его, тоже должны помочь подавить вирусную инфекцию.
Знать последовательность РНК нового коронавируса для разработки мРНК, кодирующей шиповидный белок, необходимо, но это только начало. Прежде всего форма шиповидного белка была непостоянной, и, когда вирус проникал в клетку человека, шипы его короны меняли очертания. Если шиповидный белок, созданный на основе мРНК-вакцины, приобретал такую форму, то иммунная система могла обучаться искать именно ее. Антитела, вырабатывавшиеся при этом, не соответствовали шипам коронавируса, который только проник в организм, на стадии, когда можно предотвратить заражение, и, таким образом, вакцина оказывалась бесполезна. Решение заключалось в том, чтобы добавить в цепочку шиповидного белка пару молекул пролина – особенно негибкой аминокислоты[279], этот трюк был разработан для шиповидного белка родственного вируса MERS, и таким образом шип фиксировался на своем месте.
Шахин и Тюреджи должны были еще решить, какие кодоны использовать для кодирования шиповидного белка. Эта проблема актуальна для любой мРНК-вакцины, не только против COVID–19. Генетический код обладает свойством «вырожденности», благодаря которому большинство аминокислот могут быть заданы несколькими кодонами, поэтому один и тот же белок может кодироваться триллионами возможных комбинаций. Однако некоторые последовательности проходят трансляцию эффективнее других. Благодаря опыту, который Шахин и Тюреджи получили при работе над мРНК-вакцинами против рака, теперь они смогли выбрать 20 мРНК-последовательностей для дальнейшего тестирования[280].
Тем не менее оставалось еще много вопросов. Сколько доз потребуется для эффективной стимуляции иммунной системы? Как и при какой температуре следует хранить их вакцину? Как можно в кратчайшие сроки организовать клинические испытания на людях? Тогда они позвонили Катрин Янсен, руководителю отдела вакцин компании Pfizer, и быстро договорились о сотрудничестве. В итоге огромный опыт Pfizer в производстве вакцин был использован на благо обеих компаний и всего мира[281].
В ноябре 2020 г. руководители компании Pfizer Inc. находились в нервном ожидании. Им предстояло узнать результаты клинических исследований мРНК-вакцины, которую они разрабатывали совместно с BioNTech. Когда было объявлено о 95-процентной эффективности вакцины, раздался общий выдох, а затем аплодисменты и радостные крики[282]. Руководство надеялось хотя бы на 70-процентную результативность, что уже было бы достижением для здравоохранения. В таком случае вакцина от COVID–19 по эффективности оказалась бы где-то между вакциной против гриппа (эффективность около 40%, с разбросом, в зависимости от года, от 10 до 60%) и вакциной против кори (эффективность 97%)[283]. Показатель 95 процентов был выше всяких ожиданий. Консервативная фармацевтическая компания, имеющая репутацию не склонной к риску, сделала ставку на неопробованную мРНК-технологию, и этот шаг оправдался.
В Майнце и в Кембридже, несомненно, царило такое же ликование, потому что результаты испытания вакцины компании Moderna были получены примерно в то же время и также продемонстрировали 95-процентную эффективность. Учитывая, что BioNTech/Pfizer и Moderna работали независимо друг от друга и многое сделали по-разному, например выбрали неодинаковые кодоны для кодирования шиповидного белка, удивительно, что они пришли к финишу почти одновременно и с одинаковыми по уровню эффективности вакцинами[284]. Итак, мРНК-препаратам потребовалось 30 лет, чтобы пройти путь от всеобщего пренебрежения – «слишком нестабильные», «слишком трудно проникают в клетки», «слишком иммуногенны» – до заявления, что это «укол, который спас мир»[285].
За время пандемии мы вложили беспрецедентно много средств в разработку мРНК-вакцин против COVID–19 и получили море данных об их применении и эффективности. Мы узнали и об ограничениях таких вакцин: известно, как привитые люди продолжают заболевать, хотя, как правило, менее тяжело, и как трудно вакцине угнаться за вирусом, мутирующим столь быстро. Тем не менее вряд ли возможна более впечатляющая проверка нового препарата. И действительно, Нобелевский комитет признал будущий потенциал мРНК-вакцин, наградив в 2023 г. Карико и Вайсмана Нобелевской премией по физиологии и медицине. Присуждая им награду, Нобелевская ассамблея Каролинского института отметила: лауреаты совершили прорыв, который не только позволил создать эффективные вакцины против COVID–19, но и «фундаментально изменил наши представления о том, как мРНК взаимодействует с нашей иммунной системой», проложив путь «для вакцин против других инфекционных заболеваний»[286]. Могут ли белки, образовавшиеся после введения кодирующей их мРНК, обеспечить неудовлетворенные медицинские потребности, выходящие далеко за пределы получения вакцин? Действительно ли в методах лечения грядет мРНК-революция?
На самом деле мы пока еще этого не знаем. Нам, несомненно, нужны еще высокоэффективные вакцины против других вирусных заболеваний. Например, у существующих сейчас вакцин против гриппа весьма ограниченная эффективность, потому что они не могут соответствовать всему разнообразию вирусов гриппа, у которых более 60 подтипов, называемых штаммами. Вакцинация против какого-то одного штамма защищает вас в основном именно от него. Каждый год в феврале Всемирная организация здравоохранения анализирует эпидемиологические данные из всех регионов планеты и пытается предсказать, какие вирусные штаммы будут наиболее распространены в предстоящем сезоне гриппа. Эффективность вакцины снижается, если смешать слишком много штаммов, поэтому делают препараты только против трех (трехвалентные) или четырех (четырехвалентные) из них. При производстве такой вакцины, как правило, вручную вводят вирус нужного штамма в куриные яйца. (Перед прививкой у вас спрашивают, нет ли аллергии на яйца, потому что в вакцине сохраняется небольшое количество яичного белка.) Для производства вакцины требуется шесть месяцев, поэтому не удается точно нацелить ее именно на те штаммы вируса гриппа, которые появятся в следующем сезоне. Иначе говоря, к тому моменту, когда мы точно узнаем, какой штамм гриппа преобладает на сей раз, менять вакцину будет уже поздно. Теперь, благодаря вакцинам против COVID–19, у нас есть база для производства мРНК-вакцин и возможность приготовить их гораздо быстрее, чем при введении вируса в куриные яйца. Если сделать вакцины, более точно соответствующие штамму вируса в этом году, они могут быть более эффективными. И подумайте о том, что в одних только Соединенных Штатах мы сэкономим в год 140 млн куриных яиц – сколько же из них получится омлета!
Следующей крупной проверкой для мРНК-вакцин будет их использование не только против других вирусов, но и против рака. Напомним, что и BioNTech, и Moderna разрабатывали препараты для прививки против рака до того, как с такой пользой для нас отвлеклись на COVID–19.
Как будет работать такая вакцина против злокачественных опухолей, хотя бы в теории? Ответ может показаться не очень очевидным. Вакцины против вирусов понятны: вирус – чужеродный агент, он биологически отличается от человека, поэтому иммунная система распознаёт в нем чужака и работает на его уничтожение. Шиповидный белок коронавируса – хороший пример: он характерен именно для вируса, его не может быть у неинфицированного человека, следовательно, этот белок служит однозначным сигналом об опасности. Есть некоторые виды онкологических заболеваний, про которые известно, что они вызываются вирусами, например, рак шейки матки в большинстве случаев бывает вызван вирусом папилломы человека, поэтому, опять же, вполне понятно, как вакцина «Гардасил» компании Merck спасает тысячи и тысячи людей, которые раньше гибли из-за развившегося злокачественного заболевания[287]: нет вирусной инфекции – нет рака. Однако большинство его видов возникают не из-за вируса, а потому, что нарушаются нормальные клеточные процессы.
Создание вакцины против рака реально, ведь в опухолях вырабатываются аберрантные белки, которые не встречаются в здоровых тканях человека. Из-за мутаций в ДНК, вызванных такими мутагенами, как сигаретный дым (при раке легких) или ультрафиолетовое излучение (при меланоме), образуются мутантные белки, которые могут стать причиной развития заболевания. Для осуществления иммунного надзора у клеток есть естественный механизм: внутри себя они измельчают белки на кусочки и предъявляют эти фрагменты на поверхности снаружи мембраны, где их исследуют Т-клетки. Если предъявлены частицы мутантного белка, Т-клетки распознают их как чужеродные и убивают предъявившую клетку. Логика в том, что если в клетке вырабатывается вирусный или мутантный белок, то она, скорее всего, мутантная или опухолевая и в любом случае ею стоит пожертвовать для блага организма.
В начале 1990-х гг. иммунолог Эли Гильбоа из Университета Дьюка изучал, можно ли активизировать эту естественную систему и заблаговременно с помощью мРНК обучить иммунную систему животных распознавать и уничтожать опухолевые клетки. Он провел серию тестов на мышах, у которых с помощью генной инженерии вызывали рак легких с метастазами. В этом эксперименте было два новшества. Во-первых, вместо того чтобы вырабатывать конкретную мРНК, Гильбоа выделил все мРНК из опухолей в легких мышей, чтобы научить иммунную систему распознавать целый спектр мутантных белков и реагировать на них. Во-вторых, вместо того чтобы вводить мышам непосредственно мРНК, заключенную в липосомы, он сначала выделил из организмов мышей иммунные клетки особого типа, обработал их липосомами с мРНК и ввел эти клетки обратно мышам. Это делалось, чтобы ввести мРНК именно туда, куда требуется для обучения иммунной системы, а не надеяться, что мРНК найдет в мыши нужные клетки.
Результаты Гильбоа впечатляли. Мыши, иммунные клетки которых обрабатывались опухолевой мРНК, оказались защищены при последующем введении опухолевых клеток. Распространение рака легких у таких грызунов резко прекращалось[288]. Однако то, что хорошо работает на мышах, не всегда можно эффективно перенести на человека. Было проведено более 50 клинических испытаний различных мРНК-вакцин против рака, но пока ни один препарат не одобрен[289]. Теперь, используя весь опыт, полученный при создании вакцин против COVID–19, такие компании, как Moderna и BioNTech, перезапустили свои программы по разработке противораковых мРНК-вакцин[290]. В 2022 г. Moderna в сотрудничестве с Merck объявила о чрезвычайно многообещающих результатах разработки мРНК-вакцины против меланомы[291]. Может быть, победа уже близка.
Какой вклад, помимо новых вакцин, может внести мРНК-терапия? Большинство традиционных лекарств тоже подавляют развитие заболевания, но мРНК потенциально можно использовать на другом направлении – для восстановления функционального белка, который отсутствует или мутировал у больного. К числу заболеваний, вызванных мутантными белками, относятся серповидноклеточная анемия, мышечная дистрофия, муковисцидоз и спинальная мышечная атрофия (которую Адриан Крайнер помогал лечить с помощью антисмысловых РНК). Появляется, кроме того, возможность решить важную проблему, связанную с так называемыми редкими заболеваниями, от каждого из которых в мире страдает всего несколько тысяч человек. С использованием мРНК-терапии возникает надежда, что нам удастся создать единую мРНК-платформу, куда можно будет вставить именно ту кодирующую последовательность из огромного их количества, которая нужна конкретному пациенту, чтобы затем на ее основе организм вырабатывал соответствующий необходимый ему белок.
И под конец рассмотрим терапевтические антитела, которые повлияли на вектор развития фармацевтической промышленности в 1990-х гг. Терапевтические антитела – это полученные в лаборатории версии антител, вырабатываемых В-клетками нашей иммунной системы. Их можно настроить на специфичное связывание с белковой мишенью на поверхности клетки. В некоторых случаях простое связывание с белком подавляет процесс заболевания или такое связывание сопровождается последующими полезными эффектами, например гибелью больной клетки. Среди часто назначаемых лекарств на основе терапевтических антител – «Хумира» против ревматоидного артрита, «Китруда» и «Опдиво» против злокачественных опухолей, «Дупиксент» против экземы и «Стелара» против псориаза и болезни Крона. Поскольку эти терапевтические антитела представляют собой белки, их нельзя принимать в виде таблеток: наша пищеварительная система создана для того, чтобы переваривать белки, поступающие с пищей, и не отличает лекарственные белки от еды. Поэтому терапевтические антитела обычно вводят напрямую в кровоток. Для этого, о чем уже говорилось, больному надо прийти в больницу или медицинский центр и сидеть там в течение часа, пока лекарство будет медленно поступать из иглы в руку. Такое внутривенное введение препарата дорого, утомительно и часто болезненно для пациента. Поскольку у каждого белка есть соответствующая мРНК, теоретически возможно вводить не сами антитела, а мРНК, делая подкожную инъекцию, как при вакцинации. Мы пока еще не знаем, удастся ли с помощью такой мРНК получить необходимое для лечения количество антител, но сама идея привлекательна, и сейчас исследователи в области биомедицины этот подход изучают. Явно прошли те времена, когда инвесторы не хотели вкладываться в мРНК.
Научный принцип, лежащий в основе всех этих мРНК-препаратов, прост: во всех случаях, когда необходим белок для стимуляции иммунной системы или замещения отсутствующего либо мутантного белка, вероятно, возможно использовать соответствующую мРНК, чтобы ввести в организм инструкции для создания этого белка. Реализовать эту идею на практике довольно сложно, но успех при создании мРНК-вакцины против COVID–19 послужил мощным стимулом.
На сегодняшний день мы наблюдаем, как РНК трех разных типов были превращены в эффективные лекарства. Антисмысловая РНК с дополнительными химическими модификациями, повышающими ее стабильность и облегчающими доставку, доказала свою эффективность и успешно используется при лечении спинальной мышечной атрофии – смертельного детского заболевания. Малую интерферирующую РНК применяют для лечения редких разрушительных генетических заболеваний, и, возможно, скоро ее будут использовать для борьбы с нейродегенеративными расстройствами, такими как болезнь Альцгеймера и боковой амиотрофический склероз (БАС). А для борьбы с самой страшной пандемией нашего времени сделали эффективную вакцину из мРНК, и в будущем она сможет дать человечеству новые препараты для прививок и лекарства.
Во всех трех случаях терапия работает на уровне РНК, никаких изменений в гены человека не вносят. Вообще, как мы уже убедились, одно из очевидных преимуществ мРНК-вакцин в том, что отсутствует риск изменения генома. Далее мы расскажем, как другой естественный процесс с применением РНК, с помощью которого бактерии защищаются от вирусов, можно использовать в качестве инструмента для редактирования генома любых видов, и генома человека в том числе, причем с невиданной ранее скоростью и специфичностью. В отличие от описанных ранее вмешательств с помощью РНК, новая технология, о которой пойдет речь, обеспечивает постоянные изменения в геноме, именно поэтому она столь мощна и при неправильном использовании опасна. И снова именно чудо-молекула РНК выступает катализатором этой революции.