Принцип метода
При осаждении белков крови трихлоруксусной кислотой все фосфолипиды осаждаются вместе с белковым сгустком, а неорганический и кислоторастворимый фосфор остаются в растворе. Белковый сгусток минерализуется нагреванием с хлорной кислотой, и фосфор определяется эйконогеновым методом. В связи с тем что белки плазмы не содержат фосфора, весь осаждаемый трихлоруксусной кислотой фосфор входит в состав фосфолипидов.
Необходимые реактивы
1. Кислота хлорная 57%-ная, ее концентрация должна быть 5,7 н, что проверяется титрованием. Если концентрация значительно ниже, что часто случается, так как препарат может содержать 40 или 50% НСlО4, соответственно увеличивается количество реактива, используемого при минерализации.
2. Кислота трихлоруксусная, 100 г/л (10%-ный).
3. Аммоний молибденовокислый, раствор 40 г/л. Готовят, растворяя 4 г (NH4) Mo7O24 × 4H2O в 100 мл воды.
4. Натрий кислый сернистокислый.
5. Натрий сернистокислый безводный.
6. Эйконоген, раствор.
7. Калибровочный раствор. Основной калибровочный раствор, содержащий 50 ммоль фосфора в 1 л, разводят водой в 50 раз; получается раствор, содержащий 1 мкмоль/мл.
Ход исследования
К 0,2 мл исследуемой сыворотки добавляют 3 мл воды и медленно 3 мл 10%-ного раствора трихлоруксусной кислоты, через 1–2 мин центрифугируют, надосадочную жидкость сливают – пробирку переворачивают и дают стечь жидкости. К осадку добавляют 1 мл 57%-ной хлорной кислоты; если ее концентрация ниже, соответственно увеличивают количество кислоты, переносят в колбу или в большую пробирку для сжигания и минерализуют.
Минерализация – наиболее ответственный этап определения. Дигидрат хлорной кислоты НСlО4 × 2Н2О кипит при температуре 203 °С, при более низкой температуре из пробы удаляют воду, а при повышении температуры начинает улетучиваться сама хлорная кислота. Температурный режим должен быть подобран так, чтобы пары дигидрата хлорной кислоты конденсировались на стенках и в виде капелек опускались на дно, где опять испарялись, и т. д. При оптимальных условиях минерализация заканчивается за несколько часов; если температура слишком низкая, она затягивается, если слишком высокая, хлорная кислота улетучивается, и проба будет испорчена. Лучше всего сжигать пробы в больших пробирках 20 × 200 мм, которые устанавливают в подогреваемом электричеством металлическом блоке (каждую пробирку в отдельном гнезде). Сверху пробирки прикрывают специальными затычками или колпачками, на которых также конденсируются и стекают вниз пары хлорной кислоты. Высота блока должна быть 2–3 см; большая часть пробирки, которая находится над блоком, остается свободной и относительно холодной, на ней и конденсируется хлорная кислота. Желательно, чтобы температура в блоке поддерживалась на уровне 200–210 °С с помощью электронного реле, соединенного с контактным термометром (как в термостате). Такое устройство позволяет сжигать большое количество проб с наименьшими затратами времени лаборанта, но можно работать также с круглодонными колбами с длинными горлышками (колбы Кьельдаля) на песчаной бане, но это требует большего внимания к ходу минерализации. Внешний признак того, что минерализация окончилась, – просветление проб, но он может быть обманчивым. В то же время слишком длительное нагревание приводит к потерям, поэтому перед началом серийных анализов надо отработать режим сжигания, проверяя воспроизводимость в серии.
После охлаждения к минерализованной пробе прибавляют 7 мл воды, 1 мл раствора молибденовокислого аммония и 1 мл раствора эйконогена, объем доводят водой до 10 мл. Через 20 мин фотометрируют в кюветах с длиной оптического пути 1 см при длине волны 630–690 нм против холостого опыта, в который берут 0,8 мл хлорной кислоты, 7 мл воды и далее проводят цветную реакцию так же, как и в опыте.
Для построения калибровочной кривой минерализуют калибровочные пробы, содержащие 0,2–1 мкмоль фосфора. Для этого к ним прибавляют по 1 мл хлорной кислоты и ставят нагревать вместе с опытными пробами, после чего проводят цветную реакцию. По калибровочному графику вычисляют содержание фосфора в пробе, эту величину умножают на 5 и получают концентрацию мкмоль/мл или ммоль/л.
После минерализации образовавшийся неорганический фосфор может быть определен любым методом, в том числе и наиболее чувствительным с малахитовым зеленым. Иногда в процессе минерализации образуется некоторое количество пирофосфата, что приводит к заниженным результатам анализа. В этом случае пробу после разведения водой ставят на несколько минут на кипящую водяную баню, при этом пирофосфат гидролизуется.