Унифицированный метод определения фосфора по восстановлению фосфорно-молибденовой гетерополикислоты

Принцип метода

Белки осаждают трихлоруксусной кислотой, в кислой среде фосфорная кислота образует с молибденовой кислотой фосфорно-молибденовую гетерополикислоту, которая восстанавливается эйконогеном с образованием ярко окрашенного молибденового синего.

Необходимые реактивы

1. Кислота трихлоруксусная, раствор 100 г/л (10%-ный).

2. Кислота серная 5 н.

3. Аммоний молибденовокислый, 5%-ный раствор готовят, растворяя 5 г (NH₄)₆Мо₇О₂ × 4Н₂О в 100 мл 5 н серной кислоты.

4. Натрий кислый сернистокислый NaHSO₃ (в такой форме соль существует только в растворе, это скорее коммерческое, нежели химическое название). При кристаллизации выпадает пиросернистокислый натрий (Na₂S₂O₅), который называют также метабисульфитом. Все 3 названия – бисульфит, пиросульфит и метабисульфит – синонимы. Препараты с этими названиями могут быть с равным успехом использованы для определения фосфора.

5. Натрий сернистокислый безводный, сульфид натрия Na₂SO₃.

6. Эйконоген, раствор. Растворяют полностью 6 г бисульфита натрия в 20–25 мл воды, вносят в этот раствор 0,1 г эйконогена (аминонафтолсульфоновой кислоты), который также должен полностью раствориться, на что уходит некоторое время.

7. Отдельно в небольшом объеме растворяют 1,2 г безводного сернокислого натрия, оба раствора смешивают, доводят объем до 50 мл, дают отстояться несколько часов и фильтруют.

8. Калибровочный раствор. Основной калибровочный раствор, содержащий 50 ммоль фосфора в 1 л, готовят, растворяя 702,2 мг высушенного до постоянной массы при температуре 120 °С однозамещенного фосфата калия КН₂РО₄ в 100 мл воды. Из него готовят рабочие калибровочные растворы, содержащие 1, 2 и 3 ммоль/л. Для этого 1, 2 или 3 мл основного раствора доводят водой до объема 50 мл.

Ход исследования

К 1 мл прибавляют 4 мл воды и 5 мл раствора трихлоруксусной кислоты, через 10 мин центрифугируют или фильтруют. К 5 мл безбелкового фильтрата добавляют 1 мл раствора молибденовокислого аммония, 0,2 мл раствора эйконогена и 1,8 мл воды. Через 20 мин фотометрируют при длине волны 630–690 нм в кюветах с длиной оптического пути 1 см против холостого опыта. Одновременно ставят холостой опыт, в который вместо исследуемой сыворотки добавляют воду, и калибровочные опыты, в которые вместо сыворотки берут рабочие калибровочные растворы.

Расчет проводят по калибровочному графику или правилу пропорций.

Чувствительность метода можно значительно повысить, если после добавления эйконогена пробы нагревать в течение 7 мин на кипящей водяной бане и фотометрировать при длине волны 830 нм. В этом случае вместо 5%-ного раствора молибденового аммония берут 0,5%-ный раствор в 0,5 н серной кислоте, остальные реактивы те же. Согласно унифицированному методу окончательный объем фотометрируемых проб составляет 8 мл. Если объем кюветы меньше, все дозировки можно пропорционально уменьшить.

Метод определения фосфора по образованию окрашенного комплекса малахитового зеленого с фосфорно-молибденовой кислотой

Принцип метода

Неорганический фосфор образует с молибденовой кислотой фосфорно-молибденовую гетерополикислоту, которая, реагируя с основным красителем – малахитовым зеленым, дает зеленовато-синее окрашивание.

Если фосфора нет, то малахитовый зеленый в кислой среде окрашен в желто-коричневый цвет. Белок не мешает проведению реакции, поэтому депротеинизацию не проводят, для обеспечения коллоидной устойчивости образовавшегося комплекса в раствор добавляется твин 20.

Необходимые реактивы

1. Малахитовый зеленый.

2. Аммоний молибденовокислый.

3. Цветной реактив – 1,5 г малахитового зеленого растворяют в 250 мл воды, одновременно растворяют 10,3 г молибденовокислого аммония в 250 мл 5 н НСl. Оба раствора смешивают, дают отстояться и фильтруют, за это время цвет реактива меняется.

4. Твин 20, 1,5%-ный раствор – 0,15 мл твина 20 разводят 10 мл воды.

5. Калибровочный раствор. Основной калибровочный раствор, содержащий 50 ммоль/л, готовят, растворяя 702,2 мг однозамещенного кислого фосфата калия КН₂РО₄, высушенного при температуре 120 °С до постоянной массы, в 1 л воды. Из него готовят калибровочный раствор, содержащий 20 мкмоль/л.

Ход исследования

0,02 мл сыворотки вносят в 1,5 мл воды, к раствору добавляют 2 мл цветного реактива и 1 каплю 1,5%-ного раствора твина. Через 10–15 мин фотометрируют при длине волны 600–650 нм против холостого опыта, который ставят так же, как и основной опыт, но без сыворотки.

Для построения калибровочного графика берут 0,5; 1 и 1,5 мл рабочего калибровочного раствора, т. е. 10, 20 и 30 нмоль фосфора, доводят объем до 1,5 мл, добавляют цветной реактив и раствор твина так же, как в основном опыте. Калибровочная проба, в которую взято 20 нмоль фосфора, по окраске соответствует опытной пробе, у которой взята сыворотка, содержащая фосфор в концентрации 1 ммоль/л. Калибровочные пробы, в которые взято 10 и 30 нмоль, соответствуют сывороткам, содержащим 0,5 и 1,5 ммоль фосфора в 1 л. По этим данным строится калибровочная кривая, которая и используется для Расчета.