Мы видоизменяем организмы в рутинном режиме. Мы восстанавливаем сломанные кости, подвязываем молодые деревца к опорам и даем домашнему скоту антибиотики, чтобы животным удавалось вырастать покрупнее. Эти меры влияют на белки, клетки и ткани, а также на включение и выключение генов, но все же не меняют последовательность A, Ц, Г и T в геноме. Недавно у нас появились инструменты, которые позволяют вносить такие правки и переписывать ДНК, меняя сами инструкции по построению компонентов жизни.

Еще с главы 1 мы наблюдаем, что у ДНК и остальных материалов живого организма биологическая функция неотделима от физической формы. Описывая восхитительные инструменты для чтения ДНК, я отметил, что их не удалось бы изобрести, если бы к ДНК не подошли как к физическому объекту, ведь они обязаны разрезать, наращивать, перемещать и отслеживать ДНК, учитывая ее вещественные характеристики и общие принципы самосборки и случайности. Это же относится и к редактированию генов – мы ведь вносим изменения в саму нить ДНК. Здесь, однако, мы работаем с этой молекулой внутри живых клеток, а не в спецаппарате, и потому используем другие подходы. В этой главе мы узнаем, как редактировать ДНК с помощью революционной технологии XXI века, называемой CRISPR/Cas9. Чтобы прочувствовать поразительные уникальность и мощь этого инструмента, имеет смысл рассмотреть вначале методы, предшествовавшие ему и примечательные сами по себе.

Заимствуем у бактерий

Герои этой саги о геномном редактировании – бактерии, способности которых уже не раз поражали нас в предыдущих главах. Многие виды бактерий, как и непритязательную рабочую лошадку E. coli, легко выращивать в огромных количествах в условиях лаборатории. В ведре с теплым питательным бульоном могут плавать триллионы E. coli, которые растут, делятся и производят уйму белков. Эти белки, закодированные в бактериальном геноме, расщепляют сахара, помогают клеткам перемещаться в жидкости, формируют мембраны и так далее. Что, если подарить E. coli человеческий ген, на основе которого она могла бы производить человеческий белок, например инсулин? Бактерия превратилась бы в миниатюрный фармацевтический завод – живой и способный к практически бесконечному самовоспроизводству.

Я не случайно привел в пример инсулин. У людей, страдающих сахарным диабетом I типа, не вырабатывается гормон инсулин, а значит, не регулируется уровень сахара в крови, что приводит к тяжелым нарушениям, порой даже фатальным. С 1920-х годов диабет компенсировали инсулином свиней и коров, который нужно было сложно и дорого очищать¹. Технологии совершенствовались, но даже в 1970-е для получения каких-то 450 граммов гормона требовалось переработать поджелудочные железы более чем 20 тысяч животных. Кроме того, из-за животного происхождения препарата у больных часто случались аллергические реакции. Подобно белкам Sonic hedgehog, с которыми мы встречались в главе 7, последовательности аминокислот в инсулинах человека и других животных очень похожи – похожи достаточно, чтобы выполнять свою функцию, – но все же они не идентичны, и эти незначительные различия вкупе со следовыми количествами примесей в животных экстрактах могут провоцировать мощный иммунный ответ. По всем этим причинам идея о массовом производстве человеческого инсулина казалась очень заманчивой. Однако на всем протяжении истории нашего вида до 1970-х люди оставались единственным крупным источником человеческих белков. Ситуация изменилась, когда мы научились перемещать гены от вида к виду, начав с трансформации бактерий.

Я немного задержусь на самом процессе превращения бактерий в машины, служащие нашим нуждам, поскольку лежащая в его основе философия сильно отличается от нашего подхода к небиологической инженерии. В комиксе «Кальвин и Хоббс»[61] шестилетний Кальвин спрашивает у отца: «Папа, как узнают, какую нагрузку выдержит мост?» Отец отвечает: «По нему пускают все более и более тяжелые грузовики, пока он не развалится. Затем последний грузовик взвешивают и восстанавливают мост». Кальвин поражен, а нам смешно, потому что это нелепо. Точно так же никому и в голову бы не пришло собирать автомобиль, случайным образом соединяя друг с другом детали – двигатель, оси, колеса и прочее – в поисках одной из миллиона комбинаций, способной стать рабочим транспортным средством. Зато в сфере биоинженерии такой подход вполне логичен благодаря способности биологических материалов к самосборке и их устройству из повторяющихся модулей.

В ходе эволюции бактерии обзавелись мощными инструментами для работы с ДНК, включая ферменты, называемые рестриктазами, которые разрезают двойную спираль. Разрезы вносятся не беспорядочно: каждая рестриктаза распознает специфическую последовательность нуклеотидов: как правило, ферменты «дрессируются» нападать на тот или иной участок, исходя из истории заражений бактериального вида вирусами, то есть геномами с характерными последовательностями ДНК. Иными словами, рестриктазы участвуют в защите от вирусного вторжения в ходе стародавней войны, к которой мы вернемся чуть позже. Большинство рестриктаз оставляют концы разрезанной ДНК не «тупыми», а «липкими» – это реальные научные термины, – чтобы им было проще удерживаться вместе с другими такими же концами. Липкость обеспечивается не каким-то клейким веществом, а контуром среза: с каждой из сторон разреза одна из цепей двухцепочечной ДНК выступает на несколько нуклеотидов относительно другой (см. рисунок). Выступающие концы разных фрагментов, полученных разрезанием одной и той же рестриктазой, могут связываться друг с другом по принципу комплементарности, то есть напротив A одного из них встает T другого, а напротив Ц – Г.

Другая особенность бактерий состоит в их склонности поглощать ДНК из окружающей среды, что позволяет им перенимать полезные черты у почивших соседей. Особенно часто и ловко бактериальные клетки обмениваются маленькими внехромосомными молекулами ДНК. Эти, как правило, кольцевые и способные к автономной репликации геномы, называемые плазмидами, есть у многих бактерий.

Позаимствовав описанный набор инструментов, мы сможем внедрить человеческий ген в бактерию. Сначала нужно добыть фрагмент ДНК, соответствующий интересующему нас гену, – например, гену человеческого инсулина. Можно либо воспользоваться природным вариантом из чьего-то генома, либо создать ген с нуля – такие небольшие цепочки нуклеотидов умели химически синтезировать даже в 1970-х. Как вы помните, благодаря ПЦР – еще одной технологии микробного происхождения (см. главу 1) – даже ничтожное количество ДНК можно размножить до миллионов идентичных копий. После размножения фрагмента ДНК с целевым геном внутри необходимо вырезать этот ген выбранной рестриктазой: она внесет нужные нам разрезы по обе стороны от него. Так образуется множество одинаковых копий гена с липкими концами. Параллельно нужно выделить из выращенных в огромном количестве бактерий плазмиды и расщепить их в одном-единственном месте той же рестриктазой. Если содержимое двух пробирок смешать, фрагменты целевого гена и «открытые» колечки плазмид будут перемещаться в водной среде, случайно сталкиваясь друг с другом в броуновском танце. Некоторые из них комплементарно свяжутся друг с другом и замкнутся в новые, более крупные колечки, состоящие из плазмидной ДНК и целевого гена (отмечен на рисунке изогнутыми отрезками)[62].

Некоторые колечки закрываются и без целевого гена, но вскоре мы увидим, что такие пустышки не играют роли. Главное, что нужная нам последовательность оказывается хотя бы в нескольких плазмидах. (Если приглядеться к рисунку, в остове ДНК можно заметить зазоры в точках соединения липких концов; они исчезают, когда бактериальный фермент ДНК-лигаза сшивает стыкующиеся нуклеотиды вставки и плазмиды.)

Далее необходимо доставить плазмиды в бактериальные клетки. Поглощение ДНК из среды – трансформация – само по себе происходит редко, но его можно стимулировать тепловыми или электрическими импульсами, которые открывают в бактериальной оболочке врéменные поры. И все же лишь у небольшой доли бактерий внутри окажутся исходные либо рекомбинантные (со встроенным геном) кольца ДНК. Можно, однако, провести отбор в пользу именно этих микробов, уничтожающий всех остальных. Ученые выбирают или создают плазмиды, содержащие полезные для работы гены, в том числе и те, что обеспечивают устойчивость хозяйской клетки к антибиотикам. Если бактерии после этапа трансформации поместить в среду с антибиотиком, в живых останутся лишь клетки с плазмидами. Если таких клеток мало, не беда: в питательном бульоне они превратятся в миллиарды. Разумеется, в части выживших бактерий окажутся плазмиды без вставки, но нехитрые техники определения размера или последовательности плазмидной ДНК позволят выявить и отбраковать такие варианты. В итоге мы будем размножать только правильные бактериальные клоны².

По завершении всех описанных этапов ученые получают организм, которого не существовало прежде: бактерию, несущую и экспрессирующую чужеродный ген. В 1973 году лаборатории Стэнли Коэна из Стэнфордского университета и Герберта Бойера из Калифорнийского университета в Сан-Франциско, работавшие над совместным проектом, объявили о первой успешной бактериальной трансформации³. Вскоре стал очевиден потенциал этого открытия: бактерии можно превращать в микроскопические конвейеры, производящие не свойственные им вещества. Поскольку инсулин был самой привлекательной целью, несколько лабораторий вступили в биоинженерную гонку, стремясь как можно скорее сконструировать бактериальных продуцентов этого гормона.

Группа Уолтера Гилберта из Гарвардского университета – того самого Гилберта, пионера секвенирования ДНК из главы 13, – получала ген инсулина из очищенной человеческой ДНК, но такой подход строго регламентировался. Из-за всеобщих опасений по поводу межвидового перемещения генов бурные дебаты в городском совете массачусетского Кембриджа, где находится Гарвардский университет, завершились введением моратория на все подобные работы. Один из членов совета позже сказал: «Я попытался разобраться в научной подоплеке, но пришел к выводу, что не способен дать обоснованную оценку риска. Когда я понял, что не могу решить, голосовать ли в пользу или против моратория, на научных основаниях, я обратился к политическим»⁴. Он выступил за введение моратория.

Тем временем в импровизированной лаборатории в нескольких километрах к югу от Сан-Франциско небольшой биотехнологический стартап вовсю использовал химически синтезированный инсулиновый ген, избегая нормативных и социальных коллизий, присущих работе с молекулами из человеческого организма. Атомное устройство нуклеотидов абсолютно идентично вне зависимости от способа их создания – молекула есть молекула, – но закон и общественность не всегда готовы это признать. Упомянутую молодую компанию, Genentech, основали Герберт Бойер и венчурный капиталист Роберт Суонсон. В августе 1978 года в ее биореакторах удалось впервые в истории получить человеческий инсулин бактериального происхождения⁵. Маленькая Genentech оформила партнерство с фармгигантом Eli Lilly, чтобы организовать клинические исследования, наладить масштабное производство и получить одобрение регуляторов здравоохранения. В 1983 году инсулин от Genentech вышел на рынок, фактически совершив революцию в лечении диабета и став первым генно-инженерным лекарственным препаратом для людей.

Бактериальное производство инсулина проторило путь к биологическому получению лекарств от широкого спектра заболеваний. Сегодня объем рынка биологических препаратов медицинского назначения превышает 250 миллиардов долларов. Инсулин, как и многие другие вещества, теперь производят в основном генетически измененные дрожжи, а не бактерии⁶. Дрожжи – тоже одноклеточные организмы, но они, как и мы, эукариоты. С дрожжами нас роднит целый ряд недоступных бактериям механизмов модификации белков. Инсулин синтезируется в нашей поджелудочной железе как единая аминокислотная цепь (см. главу 2), которая впоследствии разрезается на три части; две крайних части объединяются мостиком новой химической связи, а средняя выпадает. Бактерии не способны к таким химическим операциям, поэтому исследователи из Genentech закодировали два крайних фрагмента отдельными генами, чьи белки затем соединялись друг с другом. Метод с использованием дрожжей не столь заковырист и более продуктивен.

Сплайсинг риса

Чтобы научиться внедрять гены в эукариотические клетки, потребовались дальнейшие исследования и изобретения. Лишь немногие из эукариот имеют плазмиды, и эукариотические гены, как правило, встраивают в хромосомы, чтобы они надежно экспрессировались в составе общего генома. (Такой вариант модификации иногда предпочитают и в бактериальной инженерии: внедрение нужного гена в хромосому бактерии дает больше гарантий на его сохранение, поскольку плазмиды могут теряться при клеточных делениях.) Методы модификации эукариотических геномов развивают уже не один десяток лет, однако до недавнего времени они были неэффективными, неточными и трудоемкими. Все радикально изменилось лишь с появлением системы CRISPR/Cas9, поэтому я не стану подробно разбирать другие подходы, а ограничусь лишь общим обзором их тактики и примеров, где приложение таких усилий может быть оправданным.

Если представить эукариотический геном как огромную библиотеку с закрытым фондом – вроде Библиотеки Конгресса или частного собрания, – то наша задача состоит в том, чтобы как-то втиснуть на полку новую книгу. Мы могли бы оставить ее в общественном зале, но библиотекарь вряд ли отнесет ее на полку за дверью: эукариотические клетки не поглощают и не встраивают в свои геномы случайные обрывки ДНК. Наши шансы увеличиваются, когда библиотеку ремонтируют или перевозят на новое место, поскольку в суматохе нашу книгу могут подложить к остальным. Такую возможность предоставляют только что оплодотворенные яйцеклетки, пока в них не объединились родительские хромосомы. Если микроинъекцией ввести молекулы ДНК в формирующийся зародыш, они могут встроиться в геном⁷. Сразу после разработки эта техника редко оказывалась успешной и позволяла внедрять фрагмент ДНК лишь в случайные места генома, ставя под угрозу целостность генов. Дальнейшие усовершенствования повысили ее эффективность и даже привнесли во внедрение ДНК некоторую степень прицельности (таргетированности). Сейчас это стандартный метод создания трансгенных мышей, например, с генами флуоресцентных белков для слежения за клеточными функциями (см. главу 2).

Другой вариант решения библиотечной задачи – привлечь кого-то, кому будет легче проникнуть в библиотеку, – например, профессионального взломщика. Мы часто прибегаем к помощи вирусов. Вирусы запускают свои геномы в клетки и реплицируют их там либо в виде независимых молекул, либо в составе генома хозяина. Маленькие и проворные вирусы не склонны брать дополнительный груз, но немного лишнего генетического материала в них все же можно втиснуть, и тогда модифицированные вирусные частицы доставят его в клетки заражаемого организма. Вирусная доставка ДНК имеет преимущества перед микроинъекцией, поскольку все делает сам вирус, а не лаборант с тонкой иглой, и работать можно с разными типами клеток, а не только со свежеоплодотворенной яйцеклеткой. Но у этих методов сходные недостатки: они не особенно надежны и таргетны, то есть избирательность встраивания привнесенной вирусом ДНК невысока. Когда мы создаем трансгенных мышей, нам неважно, что доля успешных процедур далека от идеала. Мы проводим отбор и дальше изучаем только правильно трансформированных мышей. Но если мы хотим разработать лекарственный препарат для человека, наши требования к надежности и точности сильно ужесточаются.

Бактерии – даже те немногие из них, которые могут проникать в другие клетки и причинять им вред, – обычно не изменяют геномы эукариот. Но есть и редкие исключения. Почвенный микроб Agrobacterium tumefaciens заражает корни растений, когда у него появляется такая возможность. Эта бактерия отрезает особый фрагмент своей плазмидной ДНК (Т-ДНК) и вводит его в растительную клетку вместе с белками, которые направляют Т-ДНК в ядро и вынуждают растение задействовать механизм репарации (починки) ДНК, чтобы внедрить бактериального засланца в свой геном. В итоге синтезируются закодированные в Т-ДНК вещества, провоцирующие опухолеобразование на корнях и питающие бактерий⁸. Ученые создали модифицированную агробактерию, в которой опухолеродные гены можно заменять любыми допустимыми по размеру ДНК-фрагментами, превращая вредоносный организм в мощный и безопасный инструмент доставки генов в клетки растений.

Один из самых интересных примеров доставки ДНК с помощью Agrobacterium – генетическая модификация риса для борьбы с дефицитом витамина A. Недостаток этого витамина считается главной предотвратимой причиной детской слепоты: ежегодно он отбирает зрение у 250–500 тысяч детей⁹. Почти половина этих детей умирает в течение года после потери зрения, что становится трагическим подтверждением важности витамина A для здоровья в целом. Наш организм получает витамин A из некоторых продуктов животного происхождения и производит из разных предшественников, в том числе из бета-каротина, который придает оранжевый цвет овощам вроде моркови и батата. Бета-каротина, однако, нет в рисе, который благодаря своей дешевизне и обилию на рынке служит основным продуктом питания во многих регионах, где распространен дефицит витамина А. Побеги риса вообще-то способны производить бета-каротин: он синтезируется в листьях, где участвует в фотосинтезе. Но соответствующие гены не экспрессируются в крахмалистых зернах, которые мы как раз и едим.

Чтобы решить эту проблему, ученые под руководством Инго Потрикуса из Швейцарской высшей технической школы и Петера Бейера из Фрайбургского университета в Германии создали «золотой рис»: добавив в геном обычного риса два гена – из нарцисса и бактерии – с работающим только в зернах промотором, они обеспечили синтез бета-каротина в съедобной части растения¹⁰. Над этим проектом работали несколько лет и об успехе объявили в 2000 году. Дальнейшие улучшения[63], проведенные уже совместно с биотехнологическим гигантом Syngenta, вылились в 23-кратное повышение количества бета-каротина в золотом рисе. Впоследствии Syngenta передала связанные с этим продуктом патенты, технологии и трансгенные семена населению нуждающихся в нем стран.

Клинические исследования показали, что желто-оранжевый рис безопасно и эффективно поставляет в организм человека бета-каротин, который преобразуется в витамин A¹¹. Американское общество питания отметило, что «очень небольшое количество – возможно, чашка – золотого риса способно обеспечивать 50 % рекомендуемой суточной нормы потребления витамина A». Несмотря на это, внедрение золотого риса в аграрную практику идет исключительно медленно из-за противодействия всевозможных объединений противников генетически модифицированных организмов (ГМО)¹². В последние годы, в частности, критика направлена не столько на само растение, полезность которого сложно отрицать, сколько на то, что выращивание такого риса даст зеленый свет внедрению других ГМ-продуктов; и вообще, лучше бы бедные получали витамин А из более богатого питательными веществами рациона. Но все же наметились некоторые подвижки. В 2019 году Бангладеш, где от дефицита витамина A страдает 21 % детей, первой из стран одобрила посев семян золотого риса¹³. На Филиппинах доля таких детей в возрастной категории от шести месяцев до пяти лет за период с 2008 по 2013 год выросла с 15 до 20 % – а это тысячи обреченных на слепоту и смерть. В 2019 году Филиппины, признав безопасность употребления золотого риса, подготовили фундамент для его возделывания[64]. Золотой рис появился 20 лет назад, но споры о нем, как и о других ГМ-культурах, не угасают по сей день, подпитываясь в некоторых случаях научными знаниями, в некоторых – сложными торгово-экономическими соображениями, а во многих – расплывчатыми представлениями и частными мнениями. И конечно, более свежие технологии открывают еще больший простор для дискуссий.

CRISPR и революция в генетическом редактировании

Итак, мы уже не один десяток лет умеем изменять геномы всевозможных организмов. Но описанные выше методы лишены притягательной простоты. Организм включает в себя новый ген лишь после серии проб и ошибок, и место, где он окажется, либо не контролируется вовсе – а это непредвиденно влияет на экспрессию, – либо контролируется умеренно, но ценой еще более трудоемкой инженерии. Когда мы задались целью внедрить ген инсулина или флуоресцентного репортера в бактерию или мышь, пытаться сделать это идеально, пожалуй, можно не раз и не два, но такая стратегия пригодна не везде, особенно если мы мечтаем о лечении генетических болезней человека. Нам хотелось бы придумать простой и точный способ редактировать геномы: находя специфические последовательности ДНК, либо заменять их нужными фрагментами собственного изготовления, либо просто аккуратно вырезать из генома. И теперь у нас такой способ есть. Я рассмотрю систему CRISPR/Cas9, однако, как это часто бывает с технологиями, почти одновременно появились несколько революционных методов геномного редактирования. Альтернативные варианты – нуклеазы на основе белков с доменом «цинковые пальцы» (ZFN) и нуклеазы на основе эффекторов, подобных активаторам транскрипции (TALEN), – не могут сравниться с CRISPR/Cas9 по скорости, дешевизне и простоте применения¹⁴. Я упоминаю их исключительно ради полноты картины и чтобы дать читателю представление об атмосфере начала XXI века, насыщенной семенами идей о редактировании генома, которые готовы были вот-вот прорасти.

CRISPR/Cas9 – очень древняя или, напротив, совсем новая техника. Ее, возможно, открыли, а возможно, изобрели. Любой из этих вариантов может оказаться верным в зависимости от ракурса. Сначала посмотрим, как этим геномным инструментом оперируют его исконные обладатели, а затем обратимся к его современным версиям на службе у человека.

Природа, если воспользоваться образом Теннисона, была красна от клыков и когтей задолго до появления этих самых клыков и когтей. Даже микроорганизмы борются друг с другом. Бактерии пронзают и травят своих сородичей, амебы пожирают бактерий, вирусы заражают клетки и бесчинствуют в их геномах. Помимо вооружения у каждого из этих созданий вырабатывается защита. До недавних пор считалось, что защитные механизмы бактерий работают только в настоящем, выявляя угрозы по мере их возникновения и не запоминая прошлые обиды. Но теперь мы знаем, что бактерии обладают памятью. Как и клетки нашей иммунной системы, они ведут учет уже знакомых противников, чтобы незамедлительно среагировать при новой встрече с ними. Само открытие адаптивного бактериального иммунитета может служить символом нашего биотехнологического века, ведь оно не состоялось бы без внедрения секвенирования ДНК и современных компьютеров.

В 1987 году японские биологи, изучавшие один из генов модельной бактерии E. coli, мимоходом заметили у нее «необычную структуру» – последовательность из 29 нуклеотидов, которая повторялась в геноме пять раз через равные 32-нуклеотидные интервалы (спейсеры)¹⁵. Каково ее назначение и встречается ли она в других геномах, так и осталось загадкой. На это наблюдение особо не обратили внимания: жизнь полна странностей, по большей части не имеющих никакого значения.

В 1990-х Франсиско Мохика и его коллеги из испанского Университета Аликанте обнаружили похожие повторы ДНК в геномах нескольких архей¹⁶. Археи – это тоже одноклеточные микроорганизмы, лишенные ядер и мембранных органелл (см. главу 5). Внешне они малоотличимы от бактерий, но формируют отдельную ветвь древа жизни: как и нас, их отделяют от бактерий миллиарды лет эволюции. Мохика наткнулся на статью японцев и понял, что закрепление похожих генетических структур у столь неродственных организмов должно свидетельствовать о важности их роли в жизни микробов. В конце 1990-х, когда количество прочитанных бактериальных геномов возросло, а вычислительные инструменты позволили возиться с их сиквенсами на обычном компьютере, Мохика с коллегами нашел похожие расположенные кластерами повторы в геномах многих других бактерий и архей. Впрочем, их многочисленность и загадочность не принесли лаборатории Мохики славы и денег: она годами не могла добиться финансирования этих исследований, причем отказы обычно обосновывали ничтожной значимостью ДНК-повторов. А содержащих их геномов между тем становилось все больше. В 2002 году Мохика и Рууд Янсен из Утрехтского университета предложили назвать эти геномные структуры CRISPR: clustered regularly interspaced short palindromic repeats, «короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами». Ученые заметили и то, что вплотную к этим структурам примыкает серия генов, которые назвали Cas (CRISPR-associated, «ассоциированные с CRISPR»). Итак, CRISPR получили имя, однако их функции по-прежнему оставались тайной.

И снова на помощь пришли геномы и компьютеры. Сразу три статьи 2005 года – одна от группы Мохики и две другие из Франции, от команд Кристин Пурсел и Александра Болотина¹⁷ – сообщали, что нуклеотидные последовательности спейсеров в CRISPR совпадают чаще всего с участками геномов вирусов[65]. С незапамятных времен вирусы заражали клетки, и такое совпадение позволяло заподозрить в CRISPR элементы неизвестного прежде защитного механизма. Хотя внимание к этой теме постепенно нарастало, ни одну из трех работ сначала не оценили по достоинству. Статью Мохики, написанную первой, один за другим отвергли все престижные журналы, и ей пришлось найти более скромный приют. Тем не менее сущность CRISPR начинала вырисовываться. Зачем бережно хранить каталог ДНК-фрагментов заражавших тебя вирусов? Не иначе как для узнавания по этим «фотороботам» и обезвреживания вторженцев, если они решат атаковать тебя вновь[66].

Работая в качестве бактериальной иммунной системы, CRISPR/Cas использует комплементарность ДНК и РНК (см. главу 3), а также нуклеазную активность белков (способность расщеплять ДНК)¹⁸. Белки Cas1 и Cas2 разрезают обнаруженные ими в клетке чужеродные, скорее всего вирусные, молекулы ДНК и вставляют фрагменты в клеточный геном – в самое начало CRISPR-кассеты, добавляя заодно и новый повтор. Таким образом получается, что повторы разграничивают отдельные фрагменты (спейсеры) в библиотеке знакомых клетке вирусных геномов. Далее клетки совершают, казалось бы, безрассудный поступок и транскрибируют цепочку повторов и спейсеров в молекулу pre-crРНК (предшественницу CRISPR-РНК). Как вы помните из главы 3, транскрипция обычно служит первым шагом к синтезу белков, а синтез вирусных белков для клетки может быть опасен. РНК повторов, однако, частично комплементарна tracrРНК (trans-activating crRNA), которая считывается с участка генома поблизости от CRISPR-локуса. Каждый повтор в pre-crРНК спаривается с tracrРНК, после чего с каждым из этих РНК-дуплексов связывается белок Cas9, а особый фермент нарезает pre-crРНК на отдельные crРНК, состоящие из одного спейсера и части повтора. Так образуется набор связанных с Cas9 и скрученных в двойную спираль crРНК/tracrРНК-гибридов со свободно висящим сегментом вирусного происхождения (см. среднюю часть рисунка).

Комплекс РНК-Cas9 бродит по клетке благодаря броуновскому движению. Если среди встречных молекул ДНК ему попадается та, что содержит специфическую короткую и довольно распространенную последовательность нуклеотидов (PAM, protospacer adjacent motif), он прикрепляется к ней в этом самом месте (кстати, та же последовательность помогает Cas1 и Cas2 определять, где разрезать чужеродную ДНК для включения в CRISPR-кассету). Cas9 расшатывает связи между нитями ДНК, по сути расплавляя двойную спираль на небольшом участке. Если однонитевая РНК, которую переносит Cas9, комплементарна одной из распаренных нитей ДНК – а это возможно только с ДНК того же вируса, по фрагменту которого сформирована crРНК, – образуется ДНК-РНК-гибрид. Эта необычная, но стабильная двойная спираль занимает в Cas9 бороздку, «выстланную» положительными электрическими зарядами, которые удерживают сильно электроотрицательные ДНК и РНК на месте (см. нижнюю часть рисунка; ДНК обозначена черным).

Cas9 содержит два нуклеазных домена, способных расщеплять ДНК. Когда белок захватывает ДНК-РНК-спираль, домены меняют ориентацию так, чтобы каждый из них контактировал с одной из нитей вирусной ДНК – той, что соединилась с РНК, и той, что осталась в одиночестве. На рисунке ниже я показал самое радикальное изменение формы, где один из доменов, черная спираль, поворачивается почти на 180 градусов. Cas9 вносит в каждую нить по разрезу, и эта часть вирусного генома теряет функциональность. Белок удаляется: его дело сделано¹⁹.

Существуют разные системы CRISPR с разными наборами ассоциированных с ними белков, но я не буду углубляться в это²⁰. Базовый механизм сходен у всех, и потому я сосредоточусь на относительно простом и изящном белке Cas9, который эксплуатируют в большинстве биотехнологических проектов.

CRISPR/Cas9 как бактериальная иммунная система весьма впечатляет, ведь в ней память совмещается с защитой. На своем глубинном уровне она показывает, что миллиарды лет назад Природа решила одну из главных задач генной инженерии: научилась находить целевую последовательность нуклеотидов среди миллионов прочих и вносить в нее изменения. Поиск здесь подразумевает пользование библиотекой вирусных ДНК, а изменение – простое уничтожение расщеплением. Некоторые ученые, однако, догадались, что природные разработки можно подправить, чтобы расширить область их применения и даже сделать их созидательными.

В 2012 году группы Дженнифер Даудны из Калифорнийского университета в Беркли и Эмманюэль Шарпантье из Университета Умео в Швеции опубликовали написанную по итогам совместной работы статью, оказавшую мощнейшее влияние на научное сообщество. Авторы изящно демонстрировали редактирующие способности CRISPR/Cas9 за пределами клеток бактерий и архей. Команда Шарпантье открыла tracrРНК и объяснила многие аспекты работы Cas9. Даудна и ее коллеги специализировались на РНК, но в диапазон их исследовательских объектов входил и сложный ландшафт CRISPR-ассоциированных белков. В естественных условиях tracrРНК и crРНК, созданная на базе вируса, вместе направляют Cas9. Даудна и Шарпантье поняли, что заменой вирусной последовательности любой другой можно перепрограммировать Cas9 на желаемый пункт назначения. Кроме того, вместо tracrРНК и crРНК можно использовать соответствующим образом сконструированный и сворачивающийся единый РНК-гид. Следовательно, всего одной легкосинтезируемой нитью РНК и всего одним легкопроизводимым белком Cas9 можно обеспечить точное нацеливание на нужные участки ДНК. Чтобы разрезать ДНК там, где находится определенная последовательность нуклеотидов, надо действовать по следующей инструкции: создать молекулы единого РНК-гида, содержащие ту самую последовательность (вместо T там должны стоять У, как всегда в РНК), добавить к ним Cas9, поместить весь комплекс в интересующую вас систему – и все. Две научные группы показали, что этот метод работает в пробирке, за пределами естественной для него среды микробных клеток. Сообщая о результатах экспериментов в статье 2012 года, авторы назвали получившуюся систему «эффективной, многофункциональной и программируемой» и добавили, что она обладает «солидным потенциалом для решения задач прицельного воздействия на гены и редактирования геномов»²¹.

Статья Даудны и Шарпантье, представленная на рассмотрение в престижный журнал Science 8 июня 2012 года и опубликованная онлайн 28 июня, привлекла огромное внимание: было очевидно, что в ней описано открытие с грандиозным потенциалом. Исследовательницы получили по 3 миллиона долларов, став в 2015 году лауреатами Премии за прорыв в области естественных наук, учрежденной Марком Цукербергом из Facebook[67], Сергеем Брином из Google и другими титанами технологий. Церемония вручения премии проходит ежегодно среди знаменитостей в Кремниевой долине²².

Но вернемся в 2012 год. Исследовательская группа, возглавляемая Виргиниюсом Шикшнисом из Вильнюсского университета, 6 апреля представила в научный журнал свою статью, где тоже описывала процесс расщепления ДНК in vitro системой CRISPR/Cas9 с проводником в виде вариации tracrРНК/crРНК, но не единой молекулы, а двух РНК-фрагментов²³. Статья завершалась сходным выводом: полученные результаты «прокладывают путь к разработке универсальной, программируемой, направляемой РНК» платформы для манипуляций с ДНК. Рукопись бесцеремонно отвергли, и авторы отправили ее в другой журнал. В итоге работу опубликовали лишь в конце сентября, на три месяца позже статьи Даудны и Шарпантье. В науке признание обычно достается тому, кто пришел к финишу первым, и Шикшниса порой называют «забытым человеком CRISPR». Правда, в 2018 году он разделил с Даудной и Шарпантье премию Кавли в области нанотехнологий, размер которой составлял миллион долларов США²⁴. Не приходилось сомневаться, что открытие CRISPR принесет кому-то Нобелевскую премию, вопрос был только, кому и когда. Ответ получили в 2020-м: нобелевскими лауреатами в области химии стали Даудна и Шарпантье.

После первых статей 2012 года появилось множество других, написанных разными научными группами. Так, в 2013-м лаборатории Фэна Чжана (Институт Эли и Эдит Броуд при Массачусетском технологическом институте и Гарварде) и Джорджа Чёрча (Гарвардская медицинская школа) продемонстрировали работу CRISPR/Cas9 в культурах клеток мышей и человека²⁵. Подобно грибам после дождя, в прессе то и дело появлялись материалы, рассчитанные на широкую публику: к 2019 году одна только The New York Times опубликовала больше 100 статей с упоминанием CRISPR. Можно еще многое рассказать об истории изучения CRISPR/Cas, в том числе и о патентных спорах и драмах, проливающих свет на бизнес-составляющую современной науки, однако моя цель – разобрать научную составляющую методов и спектр их применений, а потому вернемся к науке.

Пока что мы изображали систему CRISPR/Cas9 исключительно деструктивной, расщепляющей ДНК в нужном месте. Благодаря этому ее свойству мы можем инактивировать ген. Клетки обладают механизмами выявления и починки повреждений ДНК. Такие системы репарации необходимы прежде всего для устранения дефектов, рутинно возникающих в ходе репликации ДНК, а также под действием побочных продуктов обмена веществ или физических факторов вроде ультрафиолета. Восстановлением ДНК занимаются белки, сшивающие друг с другом концы рассеченных цепей. Но при этом нередко возникают ошибки: нуклеотиды на стыке могут замениться, добавиться или выпасть. Такие ошибки часто приводят к синтезу нефункционального белка.

Природный инструментарий починки ДНК можно использовать и более конструктивно – например, для внедрения в геном новых последовательностей. Мы можем ввести в клетку фрагменты ДНК с любым желательным для нас геном. Ремонтные белки непривередливы: они сшивают любые концы ДНК, которые находят, – и с их помощью один из наших фрагментов может попасть в разрыв цепей и с обеих сторон соединиться с геномом. Возможно, вы уловите в выражении «может попасть» немало неопределенности, и будете правы: вероятностная природа микроскопического мира здесь проявляется сполна. Расщепленные Cas9 свободные концы ДНК перемещаются по законам броуновского движения. Белки, которые выявляют и чинят поврежденную ДНК, тоже блуждают. Какую пару они найдут раньше – свободный конец геномной ДНК и конец введенного в клетку фрагмента либо два свободных конца генома, – зависит от траектории их случайных перемещений, хотя мы и можем влиять на результат введением в клетку множества копий нужного гена, и тогда белок с большей вероятностью наткнется именно на него. Cas9 между тем останется в клетке – он может опять найти свою ДНК-мишень, расщепить ее и повторять процесс снова и снова. У нас есть шанс получить желаемый результат, но нет в этом уверенности. Как и в случае старых методов, нам придется совершить много ошибок, прежде чем мы добьемся успеха. Тем не менее, если все выходит как задумано, этот метод позволяет поместить наш ген ровно в то место генома, где мы хотим его видеть.

Хотя программируемые системы CRISPR/Cas9 появились от силы 10 лет назад, ученые уже изобрели более удобные схемы внедрения генетического материала. Перспективный метод праймированного редактирования, разработанный в 2019 году группой Дэвида Лю из Института Эли и Эдит Броуд, задействует широкий спектр клеточных механизмов²⁶. Я не буду вдаваться в детали, но по сути он сплавляет модифицированный Cas9 с обратной транскриптазой – белком, формирующим ДНК на матрице РНК (см. главу 13), – и включает в РНК-гид ту самую матрицу для внедряемой, измененной по сравнению с геномной последовательности ДНК. Химера из Cas9 и обратной транскриптазы узнает и разрезает в нужном месте одну из цепей геномной ДНК, а затем в месте разреза синтезирует по матрице гидовой РНК новую ДНК, уже с желаемыми изменениями. Лишний фрагмент старой цепи должны отрезать клеточные ферменты. Рисунок дает общее представление об этом многоэтапном процессе[68]: ДНК обозначена черным, РНК – серым, на измененную последовательность указывают стрелки; белок не представлен.

Группа Лю успешно применила праймированное редактирование в клеточных культурах мыши и человека и отметила, что эта техника принципиально пригодна для исправления 89 % генетических вариантов, ассоциированных с болезнями человека. (В оставшиеся 11 % входят, например, множественные копии генов, с которыми не справиться простым переписыванием участка ДНК.)

В этой искусной подгонке ДНК с помощью иголок и ниток – белков и нуклеотидов – находит отражение физическая природа биологических молекул. ДНК – это носитель генетической информации, и чтобы изменить эту информацию, мы создаем инструменты, позволяющие нам без визуального контроля захватывать, разрезать, вставлять и сшивать ДНК-фрагменты. Точность операций поражает даже с небиологической точки зрения. Размеры некоторых деталей новейших компьютерных микросхем не превышают 10 нанометров. Длина одного нуклеотида ДНК составляет около ⅓ нанометра, но его можно контролируемо заменять с помощью праймированного редактирования и других новейших подходов.

Как мы узнали, активность клетки определяется не только физическим присутствием в ней какого-либо гена. Важнейшую роль играет регуляция – контроль разных этапов реализации закодированной в нем информации (см. главу 4). Ученые уже придумали, как использовать CRISPR/Cas9 для программирования регуляторных механизмов. И снова гидовая РНК этой системы служит проводником к геномным мишеням. А вот вместо стандартного белка Cas9 здесь работают его модифицированные формы, не способные расщеплять ДНК. Чтобы отключить целевой ген, лишенный нуклеазной активности Cas9 должен просто сесть в нужном месте на ДНК и помешать работе РНК-полимеразы, как это делает обычный репрессор. Такую технику использует описанный в главе 9 переключатель, который лишает бактерию возможности направленно плыть. Но гены можно и включать – например, привязывая безнуклеазный Cas9 к активаторам транскрипции, которые рекрутируют РНК-полимеразу. Таким образом, благодаря CRISPR у нас появился удобный доступ не только к геномам, но и к их регуляторным схемам.

О томатах, T-лимфоцитах и терапии

Методы на базе CRISPR позволяют легче и изящнее изменять растения, которые тысячи лет служили мишенями генетических манипуляций. Предок помидора, который по-прежнему встречается в дикой природе, дает плоды размером с горошину. В ходе одомашнивания растения его плоды становились крупнее и питательнее – так получились знакомые нам томаты. Избирательное скрещивание позволило нам отобрать предпочтительные генетические варианты, но за традиционную селекцию мы расплачиваемся снижением генетического разнообразия и устойчивости растений к стрессам, характерной для их дикого родственника. В 2018 году ученые применили систему CRISPR/Cas9, чтобы встроить в геном дикого растения всего четыре гена одомашненных томатов²⁷. В результате оно дало плоды массой втрое больше обычной. Точность CRISPR не только бережет целостность генома, но и не допускает переноса потенциально нежелательных сцепленных генов – побочного эффекта традиционной селекции (мы видели похожее сцепление у арбуза).

Но, разумеется, больше всего нас заботит собственный организм. Медицинские подходы на базе генетического редактирования разрабатывают и внедряют с головокружительной быстротой. Эти техники не только приносят пользу, но и проливают свет на тонкости практического применения редактирующих инструментов. Чтобы системы CRISPR/Cas9 могли вырезать и вставлять фрагменты генома, эти молекулярные машины должны попадать внутрь клеток, которые мы хотим модифицировать. Лучше всего с этой задачей справляются вирусы, специально доработанные для переноса ДНК, которая кодирует белок Cas9 и необходимые последовательности РНК. Вирусы автоматически распознают клетки-мишени, прикрепляются к ним и затем проникают внутрь.

Но направить вирусы только в нужные нам клетки очень сложно. Одно из решений – извлекать целевые клетки из организма, редактировать их и помещать обратно. В 2015 году, например, ученые из Пенсильванского университета отбирали клетки крови и циркулирующие иммуноциты у пациентов, зараженных вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), который атакует T-лимфоциты, и возвращали их уже отредактированными²⁸. Еще раньше ученые заметили, что мутация в гене CCR5, кодирующем мембранный белок Т-лимфоцитов, может защищать от ВИЧ-инфекции[69]. Пенсильванская группа повредила в извлеченных Т-клетках CCR5 и ввела их в кровоток тех же пациентов. Улучшение здоровья после процедуры оказалось незначительным, но метод зарекомендовал себя как безопасный и убедил несколько научных коллективов продолжить разрабатывать это терапевтическое направление. Еще один новаторский эксперимент 2015 года тоже задействовал иммунные клетки, на этот раз взятые у донора: их отредактировали, чтобы сделать устойчивыми к противораковым препаратам, и ввели в организм годовалой девочки, которая страдала лейкозом, не отвечающим на другие методы лечения²⁹. Как правило, донорские иммуноциты провоцируют мощный и потенциально смертельный иммунный ответ у реципиента, если подходят ему не идеально. В этом же эксперименте редактирование предполагало и отключение генов, запускающих такой ответ. Организм ребенка принял модифицированные клетки спокойно, и лейкоз перешел в стадию ремиссии.

Ни в одном из приведенных примеров редактирования не использовали систему CRISPR/Cas9: ученые работали упомянутыми в начале главы инструментами, которые появились немного раньше: ZFN (в случае с ВИЧ) и TALEN (в случае с лейкозом). Сегодня разрабатывается множество методов терапии на базе CRISRP/Cas9. Вместе с тем саму модификацию стараются переносить внутрь человеческого организма, чтобы воздействовать на ткани и органы, которые невозможно извлечь из тела.

В начале 2020 года носитель редкой мутации, вызывающей слепоту, стал первым человеком, в организм которого напрямую – инъекцией вирусов в глаз – ввели систему CRISPR/Cas9³⁰. Мутация, на устранение которой она нацелена, происходит в гене белка, необходимого для построения «башенок», содержащих светочувствительные молекулы, в особых клетках сетчатки[70]. Чтобы гарантировать редактирование гена только в нужных клетках, в молекулу ДНК, кодирующую Cas9, встроили промотор, разрешить считывание с которого могут лишь факторы транскрипции, производимые именно в тех клетках сетчатки. Если проходящее сейчас клиническое исследование окажется успешным, это станет поворотным моментом в истории лечения слепоты, ведь результат теперь будет достигаться не сложной операцией или внедрением электрического имплантата, а подстройкой собственной инструкции человека по самосборке.

CRISPR и анти-CRISRP

Понимание роли биофизических принципов самосборки и регулирования помогает нам постичь механику редактирования генома. Объясняя, как Cas9 находит нужные участки ДНК, я вскользь упомянул и другую тему – случайность. Но случайность даже важнее, и контролировать или хотя бы учитывать ее в практике редактирования геномов – непростая задача. Я сказал, что Cas9 посредством удерживаемого им РНК-гида связывается с последовательностью ДНК, комплементарной гидовой РНК. В целом это так, но только сложнее. Как и в любом молекулярном взаимодействии, сродство максимально при идеальном совпадении, но при неидеальном не падает до нуля. Всегда есть вероятность, что Cas9 атакует неправильную ДНК. Насколько эта вероятность значима, зависит от ее величины и от фактора времени. Допустим, вероятность нецелевого связывания Cas9 составляет 1 к 1000. Какой бы ни была наша задача, вероятность одного промаха на тысячу попаданий приемлема. (Это даст нам, например, лишь несколько аутсайдеров в сетчатке, полной восстановленных клеток.) Но представим дальше, что Cas9 продолжает работать в клетках, синтезируясь с гена доставленной ДНК. Может, за неделю и возникнет одна ошибка, но через 1000 недель (20 лет) белок почти наверняка хоть раз промажет мимо цели во всех клетках. Реальные показатели зависят от особенностей связывания и математики вероятностей. В одних случаях выгода перевешивает риски, в других – нет. Мы могли бы существенно повысить шансы в свою пользу, если бы научились отключать Cas9 сразу после выполнения задачи, а не позволять ему блуждать активным вечно.

Кажется, что в нескончаемой конкурентной борьбе между организмами на каждую уловку у них находится ответная, против каждого оружия есть защита, а на каждую защиту есть оружие, которое эволюционирует, чтобы обойти ее. Пожалуй, неудивительно, что раз существует CRISPR, то существует и анти-CRISPR. Вирусы выработали инструменты, выводящие из строя механизмы бактериального иммунитета. Анти-CRISPR обнаружили в районе 2012 года: магистрант Джо Бонди-Деноми из лаборатории Алана Дэвидсона в Университете Торонто заметил тогда, что некоторым вирусам удается-таки закрепиться в бактериях, обладающих CRISPR-спейсерами против них³¹. Оказалось, что в ходе какого-то из прежних вторжений вирусы успели встроить в бактериальную ДНК гены своих белков, мешающих работе Cas. Систем анти-CRISPR великое множество – нам известно уже больше 50, – и нацелены они на всевозможные компоненты и этапы CRISPR-защиты³². Одни не позволяют белкам Cas объединяться с гидовыми РНК, другие – связываться с ДНК или расщеплять ее, третьи режут РНК-гиды, а механизмы многих пока непонятны. Но в каждом случае ключевыми оказываются биофизические взаимодействия. Например, блокируя связывание с ДНК, некоторые белки анти-CRISPR воспроизводят профиль электрического заряда ДНК: они копируют силовую и пространственную картину ее отрицательно заряженной поверхности, чтобы улечься в связывающую бороздку Cas, то есть занять место, предназначенное для ДНК. Кажется, вирусы используют электрические свойства ДНК в своих целях подобно тому, как мы применяем их для перемещения нуклеиновых кислот в гелях (см. главу 13).

Почти сразу после открытия анти-CRISPR ученые поняли, что новые системы могут сослужить добрую службу в редактировании генома. В 2017 году Дженнифер Даудна и другие ученые, включая Бонди-Деноми (который к тому времени возглавил собственную лабораторию в Калифорнийском университете в Сан-Франциско), показали в человеческих клетках, что введение анти-CRISPR после редактирующей системы на основе Cas9 эффективно подавляет дальнейшую модификацию ДНК, а значит, уменьшает число нежелательных генетических изменений³³.

В последних главах мы рассматривали ДНК с более широкого физического ракурса, чем в первой части книги. Знания о природе этой молекулы и ее взаимодействиях с другими веществами, будь то белки вроде полимераз и Cas9 или неорганические структуры типа полупроводников из главы 13, наделили нас способностью читать и писать на языке генов. В следующей, заключительной, главе я больше расскажу о возможностях, которые предоставляет нам эта способность. Особое внимание я уделю редактированию человеческих геномов и видоизменению экосистем – темам, при обсуждении которых на передний план выходят этические вопросы. А еще я немного поразмышляю над тем, как биофизический ракурс формирует наши представления о мире и какое значение это имеет для решения практических и фундаментальных задач.