Самыми первыми успехами в области изучения сложных органических веществ биологического происхождения отмечены исследования углеводов. В конце XIX в. химическое строение молекул простых сахаров подробно изучил немецкий химик Э.Г. Фишер (см. т. 1, глава 9, п. 9.9). В 1884 г. он начал масштабные исследования химического строения и свойств простых сахаров, которые существенным образом изменили представления об этих веществах. Итогом всей работы немецкого химика стало создание целостного учения об углеводах.
В начале 80-х гг. XIX столетия уже существовали мнения, что молекула глюкозы содержит карбонильную группу и проявляет свойства альдегидов. Фишер однозначно установил этот факт, подтвердив его целым рядом химических реакций: окислением до глюконовой кислоты и взаимодействием с фенил гидразином, в результате чего наблюдалось образование фенилгидразона и озазонов. При сопоставлении строения образующихся озазонов, немецкий ученый установил соотношение между глюкозой, фруктозой и маннозой, которую он обнаружил в 1888 г. Спустя два года Э.Г. Фишер открыл явление эпнмеризации и установил стереохимическое строение изомеров глюкозы.
Представления об асимметричном атоме углерода в рамках модели пространственного строения органических веществ Вант Гоффа — Ле Белля (см. т. 1, глава 9, п. 9.9) позволили немецкому ученому в 1891–1894 гг. установить стереохимические конфигурации глюкозы и точно предсказать строение всех возможных изомеров гексоз. Осуществив реакции взаимной изомеризации между различными гексозами, а затем между пентозами и гептозами, Фишер доказал фундаментальное значение своей систематики углеводов. В области синтетической органической химии выдающимся успехом немецкого ученого следует считать получение в 1890 г. глюкозы, фруктозы и маннозы при использовании глицерина в качестве исходного реагента.
D-глюкоза. Проекция Фишера
α-D-глюкоза. Проекция Хэуорса
Большой вклад в развитие теории строения углеводов принадлежит английскому химику У.Н. Хэуорсу. Он определил строение и изучил свойства многих ди- и полисахаров (мальтозы, лактозы, крахмала, целлюлозы и др.).
Полученные экспериментальные данные английский ученый применил для усовершенствования номенклатуры углеводов. Для обозначения пространственного строения циклических форм углеводов Хэуорс разработал систему проекций, которые стали называться его именем, и ввел в научный лексикон термин конформация.
C развитием методов анализа состава и строения химических соединений, а также с совершенствованием навыков органического синтеза ученые все смелее вторгались в тайны живой материи, стремились распознать механизмы жизнедеятельности растений, животных и человека. В первую очередь в поле зрения ученых попадали окрашенные соединения — пигменты.
Возможность экстракции спиртом зеленых пигментов листьев растений была известна уже французскому ученому Ж. Сенебье в 1782–1800 гг. В 1817 г. французские химики П. Пельтье и Ж. Кованту назвали зеленый спиртовой раствор смеси растительных пигментов хлорофиллом. Экспериментальные доказательства того, что поглощенный хлорофиллом свет приводит к фотосинтезу, были получены в 1872–1876 гг. в результате параллельных исследований, проведенных российским академиком К.А. Тимирязевым и немецким ученым Н. Мюллером.
Задача выделения чистых зеленых пигментов была решена в 1906–1908 гг. русским ученым М.С. Цветом с помощью хроматографического метода (см. т. 2, глава 4, п. 4.7). Цвет показал, что зеленый пигмент растений является смесью двух веществ, названных позже хлорофиллами а и b.
Уолтер Норман Хэуорс (1883–1950)
Химическую структуру хлорофилла тщательно изучал немецкий ученый Р. Вильштеттер. Его соотечественник Х.Э. Фишер на основании данных о точной структуре хлорофилла а в 1940 г. начал работы по химическому синтезу этого пигмента, однако осуществить его немецкому ученому не удалось{646}. Лишь в 1960 г. полный синтез хлорофилла выполнил американский химик Р.Б. Вудворд. В 1967 г. Я. Флеминг представил окончательное уточнение структур различных форм хлорофилла. C учетом последних достижений в 1990 г. Р.Б. Вудворд с коллегами разработал наиболее совершенный метод синтеза этого пигмента{647}.
X. Э. Фишеру принадлежат еще два чрезвычайно важных открытия — определение состава и строения гема — красящего вещества крови (1927 г.), который кислородом воздуха окисляется до гематина, а также билирубина — одного из пигментов желчи (1929 г.). Примерно в это же время швейцарский химик Пауль Каррер установил строение каротиноидов — важных растительных пигментов желтого или оранжевого цвета. Было установлено, что из каротинов, поступающих в организм человека с пищей, образуется витамин А.
Строение молекулы гема
Ханс Эмиль Фишер (1881–1945)
Успехи в изучении и синтезе органических соединений биологического происхождения побуждали ученых к исследованиям все более тонких процессов и механизмов жизнедеятельности растений, животных и человека, а также соединений, являющихся непосредственными участниками этих процессов. Одними из таких соединений, привлекавших пристальное внимание ученых-биохимиков, были витамины и стероиды.
Важная роль некоторых видов продуктов питания при предотвращении определенных болезней была известна еще в древности. Например, древние египтяне знали, что печень вылечивает от куриной слепоты. Ныне никого не удивляет тот факт, что это заболевание может вызываться недостатком витамина А. В 1330 г. в Пекине врачеватель Xy Сыхуэй опубликовал трехтомный труд «Важные принципы пищи и напитков». В этой книге автор постарался систематизировать знания о терапевтической роли питания и высказывался за необходимость комбинировать разнообразные продукты в целях сохранения здоровья и долголетия.
Среди западноевропейских медиков в XVII в. появились отдельные наблюдения о том, что при длительном скудном и однообразном питании у человека могут возникать опасные болезни (цинга, рахит, полиневрит, куриная слепота и др.), часто заканчивающиеся смертельным исходом.
В 1747 г. шотландский врач Джеймс Линд, находясь в длительном плавании, провел своего рода эксперимент на больных матросах. Вводя в их рацион различные кислые продукты, он открыл свойство цитрусовых предотвращать цингу. В 1753 г. Линд опубликовал «Трактат о цинге», где предложил использовать лимоны и лаймы в целях профилактики цинги. Однако эти взгляды получили признание не сразу. Тем не менее, английский мореплаватель Джеймс Кук на практике доказал роль растительной пищи в предотвращении этой опасной болезни. Отправляясь в длительное путешествие, он наполнил трюмы своих кораблей бочками с квашеной капустой, солодовым суслом и сиропом цитрусовых фруктов. За все плавание он не потерял от цинги ни одного матроса. Это было неслыханным достижением для того времени. В 1795 г. лимоны и другие цитрусовые стали стандартной добавкой к рациону британских моряков.
В начале XIX в. многие практикующие врачи в Европе стали использовать тресковый жир для профилактики и лечения рахита у детей. Намного позднее из рыбьего жира был выделен витамин D. В 1880 г. русский биолог Николай Лунин из Тартуского университета проводил опыты с рационом подопытных мышей. Он разделил их на две группы: одну из них он кормил взятыми в отдельности известными компонентами, из которых состоит коровье молоко: сахар, белки, жиры, углеводы, соли. После некоторого времени все животные этой группы погибли. В то же время мыши, которых кормили натуральным молоком, развивались вполне нормально. В своей диссертационной работе русский биолог сделал вывод о существовании каких-то неизвестных веществ, необходимых для полноценной жизнедеятельности. Вывод Лунина не нашел должного понимания в научном сообществе, поскольку другие ученые не смогли воспроизвести его результатов. Одна из причин была в том, что Лунин использовал тростниковый сахар, в то время как другие исследователи использовали молочный сахар, плохо очищенный и содержащий некоторое количество витамина В.
В последующие годы данные, свидетельствующие о существовании в пищевых продуктах особых веществ, необходимых для нормальной жизнедеятельности организма, стали стремительно накапливаться. В 1889 г. голландский врач X. Эйкман обнаружил, что куры при питании вареным очищенным рисом заболевают бери-бери, а при добавлении в пищу рисовых отрубей — излечиваются. В 1905 г. роль неочищенного риса в предотвращении бери-бери[78] у людей подтвердил У. Флетчер. В 1906 г. Фредерик Хопкинс предположил, что помимо белков, жиров, углеводов продукты питания содержат еще какие-то соединения, необходимые для человеческого организма. Такие вещества, играющие важную роль в жизнедеятельности животных и человека даже в небольших количествах, он назвал «accessory food factors». В 1910 г. первый растворимый в воде витаминный комплекс (витамин B1) из рисовых отрубей выделил японский ученый Юметаро Сузуки. Первоначально статья об открытии этого вещества была напечатана в японском журнале. Переводчик, подготовивший эту статью к изданию на немецком языке, не сумел отчетливо заявить, что описываемое вещество было обнаружено впервые, поэтому открытие японского ученого не получило должного признания в научном мире. Историческая справка об открытии наиболее значимых витаминов представлена в таблице 8.3.
Таблица 8.3
Даты открытия витаминов и пищевые продукты, в которых они содержатся
(Год открытия … Витамин … Пищевые продукты)
1913 … Витамин А (Ретинол) … Жир печени рыб
1910 … Витамин B1 (Тиамин) … Рисовые отруби
1920 … Витамин C (Аскорбиновая кислота) … Цитрусовые
1920 … Витамин D (Кальциферол) … Жир печени рыб
1920 … Витамин B2 (Рибофлавин) … Мясо, яйца
1922 … Витамин E (Токоферол) … Зародыши пшеницы, растительные масла
1926 … Витамин B12 (Кобаламины) … Печень, яйца, молоко
1931 … Витамин B5 (Пантотеновая кислота) … Мясо, неочищенные зерна злаков
1931 … Витамин B7 (Биотин) … Мясо, яйца
1934 … Витамин B6 (Пиридоксин) … Мясо, молочные продукты
1936 … Витамин B3 (Никотиновая кислота) … Мясо, яйца, зерно
1941 … Витамин B9 (Фолиевая кислота) … Зелень, овощи
Последний аргумент в 1911 г. предоставил польский ученый Казимир Функ, в то время работавший в Лондоне. Из рисовых отрубей он выделил вещество, которое даже в небольших количествах излечивало от бери-бери. Препарат был назван «Витамайн» (Vitamine), от латинского vita — жизнь и английского amine — амин, азотсодержащее соединение. Функ высказал предположение, что и другие болезни — цинга, пеллагра, рахит — тоже могут вызываться недостатком каких-то веществ. Позднее оказалось, что аминогруппа отнюдь не является характерной для этих веществ. Некоторые из них могут совсем не содержать азота, однако термин «витамины» получил широкое распространение и упрочился в науке.
C 1907 г. норвежские врачи Аксель Холст и Теодор Фрёлих, изучая симптомы бери-бери на голубях, решили провести подобные испытания на морских свинках{648}. Используя для млекопитающих рацион, который не вызывал появление бери-бери у голубей, норвежские ученые с удивлением обнаружили у морских свинок признаки цинги. Это было неожиданное открытие, поскольку ранее считали, что цинга поражает только человека. Таким образом, были найдены подопытные животные, изучение которых позволило окончательно установить причины возникновения цинги и ускорить исследования по выделению витаминов.
Выполняя исследования на морских свинках, А. Холст и T Фрёлих смогли определить те фрукты и овощи, которые содержат вещество, обладающее противоцинготным действием. C 1928 г. это вещество стали называть «растворимым в воде витамином С», хотя строение его молекулы было еще неизвестно.
C 1928 по 1932 гг. были выполнены международные широкомасштабные исследования, в результате которых удалось идентифицировать вещество, обладающее противоцинготным действием. Группа венгерских ученых под руководством биохимика Сент-Дьёрди выделила из надпочечников животных вещество, которое исследователь назвал гексуроновой кислотой. Сент-Дьёрди предположил, что именно это соединение играет основную роль в предотвращении цинги{649}.
Венгерский биохимик не мог еще с полной уверенностью утверждать, что именно это вещество является панацеей от цинги, поскольку не были проведены исчерпывающие клинические испытания. Одновременно группа американских биохимиков из Питтсбурга, возглавляемая профессором Гленом Кингом, уже в течение пяти лет пыталась выделить витамин C из лимонного сока, опираясь на результаты норвежских ученых. В конце 1931 г. А. Сент-Дьёрди предал образец полученной им гексуроновой кислоты американским коллегам для проведения клинических испытаний. Весной следующего года Г. Кинг подтвердил предположения венгерского коллеги собственными экспериментальными результатами и опубликовал статью, в которой забыл сослаться на авторство А. Сент-Дьёрди.
Альберт Сент-Дьёрди (1893–1986)
В 1932 г. венгерский биохимик установил, что высокая концентрация гексуроновой кислоты содержится в паприке. Открыв новый источник вещества, А. Сент-Дьёрди пригласил к сотрудничеству английского химика У.Н. Хэуорса, который идентифицировал новое соединение и подтвердил результаты анализа его состава синтезом.
В 1933 г. венгерский и английский ученые решили назвать выделенное соединение аскорбиновой кислотой, акцентируя внимание на противоцинготном действии этого витамина. За заслуги в изучении витамина C А. Сент-Дьёрди и У.Н. Хэуорсу в 1937 г. была вручена Нобелевская премия по медицине.
В 1933–1934 гг. оригинальный синтез аскорбиновой кислоты осуществил швейцарский химик польского происхождения Тадеуш Рейхштейн. Предложенный им метод оказался пригодным для промышленного производства витамина С. Швейцарская фармацевтическая компания «Хоффман — Ля Рош» на основе метода Рейхштейна начала массовый выпуск нового препарата, который быстро стал популярным среди жителей Европы и США.
В ряде случаев фармакологи возлагали на витамин C большие надежды, основанные, прежде всего, не на экспериментальных доказательствах клинической эффективности препарата, а на теоретических предпосылках, в первую очередь — относительно возможного антирадикального действия аскорбиновой кислоты.
В 1970 г. Л. Полинг (см. т. 2, глава 7, п. 7.5.2) опубликовал в Докладах национальной академии США статью «Эволюция и потребность в аскорбиновой кислоте», в которой выдвинул концепцию необходимости высоких доз витамина С, предполагая их оптимальными для здоровья. К этому выводу американский химик пришел путем теоретических рассуждений на основе доступной ему в то время литературы. Полинг предполагал, что высокие дозы витамина C способны защитить человека от многих заболеваний, в частности, вирусных (ОРВИ, грипп) и онкологических. Витамин C также необходим для формирования волокон коллагена, для защиты тканей организма от свободных радикалов. Полинг предложил повысить ежедневную дозу витамина C в 100–200 раз. Сам он сообщал, что вместе с женой установил для себя дневную норму витамина C в 10 г.
Чарльз Глен Кинг (1896-1988)
Тадеуш Рейхштейн (1897–1996)
Еще одной группой веществ биологического происхождения, которые в середине XX столетия вызывали повышенный интерес у химиков, оказались стероиды. При изучении этих веществ удалось выяснить, что различные виды стероидов широко распространены в живой природе[79]. Эти соединения встречаются у микроорганизмов, растений и животных. К группе стероидов относятся стерины, желчные кислоты, витамины группы D и другие вещества.
Было установлено, что одним из основных направлений химической эволюции стероидов является их специализация в качестве биологических регуляторов — гормонов.
К наиболее важным из них относятся половые гормоны, определяющие развитие и функционирование половой системы у животных и человека, а также гормоны надпочечников (кортикостероиды), Как показали исследования, все стероиды формально являются производными гипотетического углеводорода стерана. Выдающимся достижением биоорганической химии стал синтез Р.Б. Вудвордом в 1951 г. холестерина — наиболее известного соединения из группы стероидов.
Роберт Бернс Вудворд (1917–1979)
Строение стероидов: I — молекула стерана; II — молекула холестерина
Роберт Робинсон (1886–1975)
Уже в 1930-х годах британские химики К. Ингольд и Р. Робинсон занимались изучением еще одной группы органических веществ растительного происхождения алкалоидов. Поэтому Р. Робинсона можно считать одним из основоположников химии природных соединений{650}. В частности, взамен формулы Кекуле (см. т. 1, глава 9, п. 9.7) Р. Робинсон предложил использовать новое обозначение бензола с кольцом внутри шестичленного цикла. Английский химик исследовал строение многих алкалоидов, изопреноидов, антоцианов, установил структуру морфина, стрихнина, разработал синтез атропина, кокаина, пеларгонидина и других соединений. Предложенные Робинсоном схемы биогенеза алкалоидов послужили основой для многочисленных экспериментальных работ в этой области. Исследуя механизмы взаимодействия органических веществ, Р. Робинсон и К. Ингольд предложили эмпирические правила, с помощью которых можно было прогнозировать реакционную способность исходных молекул[80].
Строение молекулы морфина
По всей видимости, Р. Вудворд стал первым химиком-синтетиком, кто применил идеи Робинсона для прогнозирования структуры синтезируемых соединений. Пример американского химика вдохновил сотни других ученых, которые работали в области создания
сложных структур природных продуктов, важных в медицинском отношении. Вудворд завоевал всемирное признание как химик-синтетик после того, как в 1944 г. вместе со своим коллегой У.Э. Дерингом он получил хинин — то самое соединение, за которым вслепую охотился юный У. Перкин (см. т. 2, глава 8, п. 8.3.2).
В течение 40–60-х гг. XX столетия, помимо холестерина, Р. Вудворд синтезировал целый ряд сложных природных продуктов, таких как кортизон (1951), резерпин (1956), хлорофилл (1960), тетрациклин (1962), лизергиновую кислоту, цефалоспорин и колхицин. Работы американского химика часто включали активное использование новых инструментальных методов: ИК-спектроскопии, а позднее, и ядерного магнитного резонанса (ЯМР). Другая важная особенность синтезов Вудворда была в том, что он обратил внимание на стереохимию, или особую конфигурацию молекул в трехмерном пространстве. Такой подход позволил установить строение ряда важных природных соединений: стрихнина, террамицина и ауреомицина, магнамицина.
Как считают многие историки науки, Р. Вудворд открыл новую эру в органическом синтезе — иногда ее называют «эпохой Вудворда». Американский ученый доказал, что природные продукты можно синтезировать в лабораторных условиях. Для этого только необходимо тщательно соблюдать принципы физической и органической химии, а также детально планировать все стадии эксперимента.
Многие процессы, которые успешно провел Р. Вудворд, казались многим его современникам неосуществимыми в лабораторных условиях. Все его синтезы несли в себе элемент искусства. Поэтому с тех пор химики-органики обращают внимание не только на удобство и практичность процесса, но и на его изящество.
В большинстве случаев природные вещества, использующиеся в медицине, обладают необходимой биологической активностью только в виде чистых энантиомеров. Это привело к востребованности «стереоспецифического синтеза», в результате которого получается продукт с определенной конфигурацией. Сегодня методы стереоспецифического синтеза широко используются. Вудворд же в свое время первым показал, что для осуществления такого (стереоспецифического) синтеза нужна основательная подготовка и тщательное планирование. Многие его работы были направлены на изменение конфигурации молекул посредством внедрения в них жесткого структурного элемента. Особенно показательными в этом отношении были синтезы резерпина и стрихнина. В настоящее время эта методика получила широкое признание.
Для определения структуры сложных молекул Вудворд применял не только ИК-спектроскопию и ЯМР, но и пристально изучал химическую деградацию молекул. Наиболее заметными примерами такого подхода следует считать синтез сантониновой кислоты, стрихнина, магнамицина и терамицина. Только Вудворду удалось вывести правильную структуру терамицина. Никто больше не смог бы этого сделать в то время. Все эти случаи показывают, как исключительный рационализм мышления и знание химических принципов, объединенные с интуицией, могут быть использованы для достижения поставленной цели.
В начале 1950-х гг. Р. Вудворд и британский химик Джефри Уилкинсон предложили новую структуру ферроцена — соединения, состоящего из комбинации органических молекул с железом. Это стало началом индустриального использования металлоорганической химии. Американский химик получил Нобелевскую премию в 1965 г. за синтез сложных органических молекул. В своей Нобелевской лекции он описывал полный синтез антибиотика цефалоспорина, отметив, что ему пришлось ускорить синтез, чтобы успеть закончить его до Нобелевской церемонии.
Важнейшей задачей для Р. Вудворда и его научной группы в 60-х гг. XX столетия явился сложнейший по тем временам синтез витамина B12. Плодотворно сотрудничая с командой из почти сотни сотрудников и студентов, в течение нескольких лет американский химик трудился над синтезом этой молекулы. Работа была окончена и опубликована в 1973 г., обозначив собой поворотный пункт в истории органической химии. Синтез включал почти 100 стадий, каждая из которых тщательно планировалась и анализировалась, что было характерно для всех работ Вудворда. Американский ученый убедительно доказал, что синтез любого сложного вещества возможен при достаточном времени и разумном планировании эксперимента.
Основываясь на наблюдениях, сделанных в процессе синтеза B12, Р. Вудворд совместно с Р. Хофманом разработали правила, объясняющие стереохимию продуктов органических реакций{651}. Р. Вудворд сформулировал свои идеи, основываясь на своем опыте химика-синтетика, а затем попросил Хофмана выполнить теоретические вычисления для подтверждения этих гипотез. Основная идея состояла в следующем: орбитальная симметрия сохраняется в синхронных реакциях. Процесс протекает легко, если существует соответствие между характеристиками симметрии молекулярных орбиталей. Если такого соответствия нет, то реакция протекает сложно. Корректность этих правил Вудворда-Хофмана была подтверждена впоследствии многими экспериментами.
Почти все вышеназванные биоорганические соединения (витамины, пигменты и стероиды) состоят из молекул, в которых количество атомов чаще всего не превышает 100. Большинство этих соединений в чистом виде представляют собой твердые кристаллические вещества и практически не распадается на составные части при умеренной химической обработке. Однако в организме животных и человека содержатся органические соединения, состоящие из поистине гигантских молекул. Такие молекулы построены из тысяч и миллионов атомов. Тем не менее, в структуре таких высокомолекулярных соединений можно выделить сравнительно небольшие повторяющиеся фрагменты, своего рода «строительные блоки».
Комплексное применение химических и физических методов анализа (см. т. 2, глава 4, п. 4.7) позволяло ученым получить общие представления о структуре макромолекул, однако основные усилия исследователей были сосредоточены на установлении детального строения этих биоорганических соединений. Особое внимание химики и биологи уделяли изучению строения молекул белка.
К этому времени ученые ясно представляли, что гигантские молекулы таких веществ, как крахмал и целлюлоза, являются полимерами, т. е. образованы одним многократно повторяемым блоком — молекулой глюкозы. Поэтому молекулы крахмала или целлюлозы, образующиеся в клетках различных растений, имеют практически одинаковый состав и свойства. Гораздо сложнее дело обстояло с белками. Молекулы этих соединений чрезвычайно разнообразны, и это создавало большие трудности при попытке их характеризовать и классифицировать.
Первые попытки изучить белки были предприняты еще в XVIII столетии. Эти вещества были выделены в отдельный класс биологических молекул в результате работ французского химика А. Фуркруа (см. т. 1, глава 6, п. 6.7.3) и ряда других ученых. Уже в конце XVIII в. было отмечено свойство белков коагулировать (денатурировать) под воздействием нагревания или кислот.
В начале XIX в. появились первые работы по изучению химического строения белков. Французские ученые Ж.Л. Гей-Люссак и Л.Ж. Тенар (см. т. 1, глава 8, п. 8.5) попытались установить элементный состав белков, взятых из разных источников, что положило начало систематическим аналитическим исследованиям, благодаря которым был сделан вывод о том, что все белки сходны по набору элементов, входящих в их состав. В то время были исследованы такие белки, как альбумин («яичный белок»), фибрин (белок крови) и глютен, выделенный из зерна пшеницы.
Голландский химик Г.Я. Мульдер провел анализ состава белков и выдвинул гипотезу, что практически все белки имеют сходную эмпирическую формулу C400H620N100O120PS{652}. В 1836 г. он представил первую модель химического строения белков. В 1838 г. совместно со шведским химиком Й.Я. Берцелиусом (см. т. 1, глава 8, п. 8.11) для обозначения подобных молекул Мульдер предложил термин «протеин» (от греч. πρωτείος ; proteios — первый, главный){653}. Голландский химик установил, что продуктами разрушения белков являются аминокислоты. Для одной из них (лейцина) с малой долей погрешности он определил молекулярную массу Mr = 131 а. е. м. Основываясь на теории радикалов, он сформулировал понятие о минимальной структурной единице состава белка — C40H62N10О12. Мульдер полагал, что этот радикал в молекулах белков может соединяться в различных пропорциях также с атомами серы и фосфора.
Геррит Ян Мульдер (1802–1880)
Теория Мульдера способствовала увеличению интереса к изучению этого класса органических соединений и совершенствованию методов белковой химии. Были разработаны приемы выделения белков путем экстракции растворами нейтральных солей. Впервые были получены белки в кристаллической форме (гемоглобин, некоторые белки растений). Для анализа белков стали использовать их предварительное расщепление с помощью кислот и щелочей.
Одновременно все большее внимание стали уделять изучению биологической функции белков. Й.Я. Берцелиус в 1835 г. первым высказал предположение о том, что они играют роль биокатализаторов (см. т. 1, глава 8, п. 8.11). Вскоре были открыты протеолитические ферменты — пепсин (Т. Шванн, 1836 г.) и трипсин (Л. Корвизар, 1856 г.). Это привлекло внимание к физиологии пищеварения и анализу продуктов, образующихся в ходе расщепления питательных веществ. По мере накопления новых данных о белках теория Г.Я. Мульдера стала неоднократно подвергаться сомнениям, но, несмотря на критику, до конца 1850-х она еще считалась общепризнанной.
Э.Г. Фишер, который ранее детально изучил строение молекул углеводов (см. т. 1, глава 9, п. 9.9), в начале XX столетия обратил свой взор на макромолекулы белков. Его работы, выполненные в 1899–1908 гг., внесли большой вклад в понимание строения белков и их биохимической роли в живых организмах. Немецкий ученый впервые применил эффективные аналитические методы органической химии для изучения этих соединений и доказал, что белки состоят из α-аминокислот. Используемые методы позволили Фишеру идентифицировать несколько новых аминокислот, в том числе, содержащих циклические радикалы: пирролидин-α-карбоновую кислоту и гидроксопролин.
Определенный вклад в процесс изучения химической природы белков внес русский химик-органик Н.Д. Зелинский, который разработал оригинальный метод синтеза α-аминокислот. Помимо анализа, Э.Г. Фишер стремился синтезировать вещества, состоящие из нескольких аминокислот. При этом немецкий химик установил, что в белках аминокислоты связаны между собой посредством амидной (пептидной) связи.
В 1901 г. в сотрудничестве с Э. Фоурно немецкий химик осуществил синтез дипептида — глицилглицина, состоящего из двух остатков аминоуксусной кислоты. Позднее ему удалось синтезировать три- и полипептиды. В 1907 г. Э.Г. Фишер синтезировал вещество, объединяющее восемнадцать аминокислот, и показал, что оно обладает рядом свойств, характерных для белков.
Фредерик Сенгер (род. в 1918 г.)
Однако определить порядок расположения аминокислот в полипептидной цепи молекулы природного белка удалось лишь полвека спустя. Этому открытию предшествовала интенсивная и скрупулезная работа многих сотен ученых и практиков. Неоценимую помощь в процессе расшифровки строения природного белка оказал хроматографический метод анализа (см. т. 2, глава 4, п. 4.7).
В конце 40-х — начале 50-х гг. XX столетия с помощью метода бумажной хроматографии химики смогли обстоятельно проанализировать смеси аминокислот, полученные при расщеплении ряда белков. Итогом этой работы явилось установление общего числа остатков каждой аминокислоты, однако определить порядок их соединения в полипептидную цепь при этом еще не удалось. C 1945 г. в процессе изучения инсулина — гормона белковой природы, включающего в свой состав примерно пятьдесят аминокислот, — английский химик Фредерик Сенгер применял электрофорез и бумажную хроматографию. Он расщепил макромолекулу на несколько более коротких фрагментов. Английский химик разработал динитрофторбензольный метод идентификации концевых аминогрупп в пептидах, с помощью которого ему удалось установить природу и последовательность чередования аминогрупп в инсулине и расшифровать его строение{654}.
Сенгер доказал, что инсулин имеет общую формулу C337N65O75S6, три сульфидных мостика и состоит из двух цепей: цепи А, содержащей 21 аминокислотный остаток, и цепи В, содержащей 30 аминокислотных остатков. Эти работы послужили основой для синтетического получения инсулина и других гормонов. Позднее таким же образом было установлено подробное строение молекул белка, содержащих гораздо большее количество аминокислот.
Следующим шагом в исследовании белка явился реальный синтез молекул полипептидов с заранее заданным порядком расположения аминокислотных остатков. Основы такому синтезу положили работы американского ученого В. Дю-Виньо. Ему удалось получить гормоны задней доли гипофиза — вазопрессин и окситоцин — полипептиды, содержащие восемь аминокислотных остатков. Метод, предложенный американским биохимиком, быстро прогрессировал, и вскоре были синтезированы полипептидные цепи, содержание несколько десятков аминокислот. К 1963 г. в лабораторных условиях удалось получить полипептидные цепи молекул инсулина.
Винсент Дю-Виньо (1901–1978)
Новое слово в методике синтеза белковых молекул представляли работы американского химика Р.Б. Меррифилда. В 1963 г. он обнародовал метод твердофазного синтеза полипептидов, который приобрел известность как метод Меррифилда. Этот способ синтеза был основан на присоединении блокируемой аминогруппы к носителю из синтетической смолы — хлорметилполистирола. C этого момента в сфере изучения белковых молекул начался стремительный прогресс.
Ученые-биохимики осознавали, что знание о порядке расположения аминокислот в полипептиде не исчерпывало всей необходимой информации об уровнях организации белковой молекулы. Даже при осторожном нагревании белки нередко необратимо утрачивают свои свойства, присущие им в природном состоянии, другими словами, наблюдается денатурация белков. При этом чаще всего, денатурация не сопровождается расщеплением полипептидной цепи, поскольку для этого требуются более жесткие условия. В связи с этим у ученых возникли догадки, что полипептидные цепи образуют какую-то определенную структуру под действием более слабых «вторичных связей». Было установлено, что в образовании таких связей принимает участие атом водорода, входящий в состав пептидной группировки и находящийся между атомами кислорода и азота. Такая водородная связь оказалась в двадцать раз слабее обычной ковалентной связи.
В начале 50-х гг. XX в. выдающийся американский химик Л. Полинг (см. т. 2, глава 7, п. 7.5.1) предположил, что полипептидная цепь в молекулах белков свернута в спираль и удерживается в этом положении водородными связями{655}. Эта идея оказалась особенно конструктивной при объяснении строения относительно простых фибриллярных белков, из которых состоят покровные и соединительные ткани.
Роберт Брюс Меррифилд (1921–2006)
Джон Коудери Кендрю (1917–1997)
Макс Фердинанд Перуц (1914-2002)
В конце 1950-х гг. компания Armour Hot Dog Со. смогла очистить один килограмм бычьей панкреатической рибонуклеазы А, которая стала экспериментальным объектом для многих ученых. Используя в своих исследованиях модифицированный метод рентгеноструктурного анализа (см. т. 2, глава 7, п. 7.5.3), английские химики Макс Фердинанд Перуц и Джон Коудери Кендрю обнаружили, что более сложные по структуре глобулярные белки также образуют вторичную структуру или так называемую а-спираль, существование которой предсказывал Л. Полинг. Детальные исследования гемоглобина и миоглобина (белков крови и мышечных тканей соответственно, способных обратимо присоединять кислород) показали, что активным центром молекул двух этих белков является гем, ответственный за связывание кислорода{656}.
Первые данные о структуре белков, основанные на дифракции рентгеновских лучей, были получены в 60-х гг. XX столетия. Через двадцать лет изучение строения белковых молекул на уровне отдельных атомов стали проводить с помощью ЯМР. В настоящее время для получения белков в химически чистом виде используют целый ряд методов: ультрацентрифугирование, осаждение, электрофорез и хроматографию. Появление генной инженерии значительно расширило спектр возможностей для выделения белков. При изучении структуры и свойств белковых молекул сейчас используют направленный мутагенез, ядерный магнитный резонанс (ЯМР) и масс-спектрометрию. Появление мощных и быстродействующих компьютеров стало еще одним новым эффективным инструментом, способствующим изучению сложных механизмов взаимодействия белковых молекул. В частности, с помощью компьютерного моделирования исследуют процессы свертывания белковых молекул, а также прогнозируют вероятную третичную структуру белка в зависимости от последовательности соединения аминокислот в молекуле. В 2006 г. Банк данных о белках (Protein Data Bank) содержал уже детальную информацию о строении и свойствах около 40 000 различных белковых молекул.
Еще одним важным объектом пристального внимания ученых-химиков стали нуклеиновые кислоты. Интерес к изучению этих соединений возник еще во второй половине XIX в. Оказалось, что биоорганические макромолекулы сравнительно легко можно расщепить на образующие их блоки. Американский химик (родом из России) Фебус Аарон Левин начал работать именно в этом направлении: он изучал строение нуклеотидов — тех блоков, из которых построены гигантские молекулы нуклеиновых кислот.
Фебус Аарон Левин (1869–1940)
Уже в 1868 г. швейцарский биохимик И.Ф. Мишер, которого считают первооткрывателем ДНК, впервые выделил из клеток гноя (лейкоцитов) вещество, названное им нуклеином (от лат. «нукс» — ядро ореха, а окончание «ин» означало, что оно содержит азот, подобно белкам, или протеинам). В 1874 г. швейцарский ученый провел элементарный химический анализ нуклеина, выделенного из сперматозоидов лосося, и установил его кислотные свойства.
В 1879 г. немецкий химик Альбрехт Коссель (отец В. Косселя) открыл в нуклеине соединение желтого цвета, которое оказалось гуанином, ранее выделенным из перуанского гуано — помета птиц, ценного азотного удобрения. Впоследствии он же выделил тимин из клеток вилочковой железы крупного рогатого скота (от греч. тимус —бык), цитозин (от греч. cytos — клетка) и аденин (от греч. aden — железа). Ф.А. Левин установил, что, кроме тетрады азотистых оснований: аденина, гуанина, тимина и цитозина — нуклеин содержит еще фосфорную кислоту и углевод дезоксирибозу{657}. Термин «нуклеиновые кислоты» был предложен в 1889 г.: нуклеиновыми они были названы потому, что впервые были открыты в ядрах клеток, а кислотами — из-за наличия в их составе остатков фосфорной кислоты. Позднее правильность выводов Левина полностью подтвердили работы шотландского химика А.Р. Тодда, который в конце 40-х гг. XX столетия синтезировал ряд нуклеотидов и родственных им соединений.
Иоганн Фридрих Мишер (1844–1895
Позже было показано, что нуклеиновые кислоты (HK) построены из большого числа нуклеотидов (от нескольких десятков до сотен миллионов). В состав каждого нуклеотида входит азотистое основание, углевод (пентоза) и фосфорная кислота.
Биологическая функция вновь открытого вещества была неясна, и долгое время нуклеиновые кислоты рассматривали как запасники фосфора в организме. Более того, даже в начале XX в. многие биологи считали, что HK не имеют никакого отношения к передаче наследственности, поскольку строение молекул, по их мнению, было слишком однообразным и не могло содержать закодированную информацию.
Постепенно было доказано, что именно дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК), а не белки, как считалось раньше, является носителем генетической информации. Одно из первых решающих доказательств принесли эксперименты по трансформации бактерий, выполненные в 1944 г. О. Эвери, К. Мак-Леодом и М. Мак-Карти. Им удалось показать, что за так называемую трансформацию (приобретение болезнетворных свойств безвредной культурой в результате добавления в нее мертвых болезнетворных бактерий) отвечают выделенные из пневмококков ДНК. Эксперимент американских ученых Алфреда Херши и Марты Чейз (эксперимент Херши-Чейз, 1952 г.) с помеченными радиоактивными изотопами белками и ДНК бактериофагов показали, что в зараженную клетку передается только нуклеиновая кислота фага, а новое поколение фага содержит такие же белки и нуклеиновую кислоту, как исходный фаг.
Эти исследования свидетельствовали о том, что нуклеиновые кислоты присутствуют в клетках всех живых организмов. При этом они выполняют важнейшие функции по хранению и передаче генетической информации, а также участвуют в механизмах, при помощи которых эта информация реализуется в процессе синтеза клеточных белков. В организме они могут находиться в свободном состоянии и в комплексе с белками (нуклеопротеиды).
Вплоть до 50-х годов XX в. точное строение ДНК, как и способ передачи наследственной информации, оставались неразгаданными. Хотя и было доподлинно известно, что ДНК содержит несколько цепочек, состоящих из нуклеотидов, никто не знал точно, сколько этих цепочек и как они соединены между собой.
Л. Полинг был убежден, что предложенную им спиральную модель строения макромолекул белка можно распространить и на нуклеиновые кислоты. В начале 50-х годов XX в. английский физик Морис Уилкинс применил метод рентгенографического анализа для изучения структуры нуклеиновых кислот. Результаты его исследований хотя и подтвердили справедливость предположения Л. Полинга, однако свидетельствовали о том, что реальная структура молекул рибонуклеиновой (РНК) и дезоксирибонуклеиновой (ДНК) кислот несколько сложнее.
Морис Хью Фредерик Уилкинс (1916–2004)
Структура двойной спирали ДНК была предложена Френсисом Криком и Джеймсом Уотсоном в 1953 г. на основании рентгеноструктурных данных, полученных М. Уилкинсом и Розалинд Франклин. Одним из важнейших вкладов Р. Франклин в создание модели строения ДНК стало ее выступление в ноябре 1951 г. В своей речи она представила присутствующим, среди которых был и Дж. Уотсон, две возможные формы молекулы ДНК: типа А и типа B, а также вариант ее строения, при котором фосфатные группы расположены с наружной части молекулы. Английская исследовательница также определила количество воды в молекуле и ее соотношение в различных частях структуры. Эти данные оказались чрезвычайно важными: они проливали свет на причины сохранения стабильности молекулы. Р. Франклин первая открыла и сформулировала те факты, которые впоследствии составили основу для последующих попыток построить модель молекулы ДНК.
Большое значение в установлении строения молекулы ДНК сыграли правила Чаргаффа{658}, согласно которым в каждой молекуле ДНК соблюдаются строгие соотношения, связывающие между собой количество азотистых оснований разных типов:
а) Количество аденина (А) равно количеству тимина (Т), а гуанина (Г) — цитозину (Ц): А = Т, Г = Ц;
б) Количество пуринов равно количеству пиримидинов: А + Г = T + Ц;
в) Количество оснований с 6 аминогруппами равно количеству оснований с 6 кетогруппами: А + Ц = Г + T
г) Соотношение (А + Т): (Г + Ц) может быть различным у ДНК разных видов.
У одних преобладают пары АТ, в других — ГЦ.
Правила Чаргаффа, наряду с данными рентгеноструктурного анализа, сыграли решающую роль в расшифровке структуры ДНК Дж. Уотсоном и Ф. Криком{659}.
Фрэнсис Крик и Джеймс Уотсон доказали, что удовлетворительно объяснить результаты дифракционных исследований можно, лишь несколько усложнив модель строения молекул нуклеиновых кислот. Каждая молекула РНК или ДНК должна представлять собой двойную спираль, образованную навитыми вокруг общей оси цепями нуклеотидов{660}. Помимо установления структуры ДНК, ученые объяснили, как происходит копирование ее молекул при делении клеток (см. цв. иллюстрации к данной главе). Уотсон и Крик подтвердили тот факт, что нуклеиновые кислоты имеют огромное значение для наследственной передачи признаков и свойств организмов{661}.
Розалинд Франклин (1920–1958)
Френсис Гарри Комптон Крик (1916–2004)
Позже предложенная Уотсоном и Криком модель строения ДНК была доказана экспериментально, а их работа отмечена Нобелевской премией по физиологии и медицине 1962 г. Среди лауреатов не было скончавшейся к тому времени Розалинд Франклин, так как премия не присуждается посмертно. Расшифровка структуры ДНК и обозначение ее роли в жизнедеятельности растений, животных и человека составляет основу современной молекулярной генетики и является одним из важнейших открытий XX столетия.
