В моем университетском кабинете есть полка, заполненная сувенирами, привезенными с конференций, и маленькими презентами от бывших студентов. Среди них стоит зеленая пластиковая бутылка с таблетками – кто-то подаривший ее решил, что это любопытная вещь. Этикетка на бутылке смело обещает «омоложение клеток через активацию теломеразы».
Эти таблетки – одна из многочисленных новомодных добавок, которые продают, чтобы нажиться на ореоле «бессмертия» вокруг содержащего РНК фермента теломеразы. На Amazon можно купить «защищающий теломеры» крем против старения под названием Youth Shots («порции молодости») по, казалось бы, разумной цене 25,99 доллара. А тем временем капсулы, содержащие «активатор теломеразы», фирмы HealthyCell набрали 400 пятизвездочных оценок, и один покупатель даже утверждает в отзыве, что этот продукт вылечил его мать от болезни Альцгеймера. В другом отзыве написано, что продукт еще и «прекрасен на вкус».
Мне очень странно видеть, как этот фермент – теломераза – всего за несколько десятилетий превратился из мудреной научной темы в модное слово. В 1980-х гг. теломераза была интересна только нашей небольшой группе исследователей, изучавших прудовую тину. Теперь теломеразу рекламируют как настоящий источник вечной молодости, и это часть многомиллиардной индустрии борьбы со старением[179]. Может показаться, что стремление к бессмертию – призрачная мечта сумасбродных миллиардеров. Между тем оно, по крайней мере на клеточном уровне, уже существует. И теломераза – тот секретный ингредиент, который позволяет достичь его.
Теломераза состоит из белков и РНК. Она добавляет защитный генетический материал к теломерам – кончикам хромосом – и тем самым поддерживает способность клеток к делению. Хромосомы – форма хранения ДНК в ядре клетки, их можно сравнить с нитями жемчуга. Без теломеразы нить укорачивается при каждом делении клетки, поскольку на конце нити становится на одну жемчужину меньше. В результате такого укорачивания клетки в определенный момент перестают делиться, наступает состояние сенесценции – клеточного старения, то есть старость. Но теломераза этого не допускает. Она добавляет жемчужины к концам хромосомной нити, предотвращая старение, так что клетки остаются вечно молодыми.
В эмбрионе человека теломеразу вырабатывают быстро делящиеся клетки, но к моменту рождения в большинстве наших клеток этот процесс прекращается. Из правила есть некоторые исключения; так, теломераза продолжает вырабатываться в настоящем чуде природы – наших стволовых клетках. В отличие от большинства других клеток, которые при делении производят две идентичные копии самих себя, стволовые клетки делятся асимметрично, то есть их потомки отличаются друг от друга. Одна дочерняя клетка становится новой стволовой клеткой, как и исходная, а другая дифференцируется, превращаясь в одну из клеток того типа, которые нужно восполнить где-то в организме, например в коже, крови, волосяных луковицах, пищеварительной системе либо в других внутренних органах или тканях. Контролируемое деление стволовых клеток позволяет организму человека обновляться, и этот жизненно важный процесс был бы невозможен без теломеразы. Но хотя наличие теломеразы необходимо для правильной работы стволовых клеток, оно характерно и для большинства форм рака. Когда опухолевые клетки получают возможность восстановить выработку теломеразы, они избегают нормального процесса клеточного старения и обретают бессмертие, что часто имеет для нас летальные последствия.
Так что же такое теломераза – чудо или проклятие? Поскольку этот использующий РНК механизм дает клеткам возможность непрерывно делиться и не стареть, вполне естественно поинтересоваться, можно ли как-то использовать его силу для продления жизни не одиночной клетки, а всего организма. Может ли лекарство на основе теломеразы действительно остановить ход наших биологических часов? Чтобы приступить к ответу на этот вопрос, вернемся к моему любимому одноклеточному пушистому комочку – тетрахимене.
В 1977 г., еще будучи в постдокторантуре Массачусетского технологического института, я поехал на своем стареньком Volvo с механической коробкой передач из Кембриджа в Нью-Хейвен, чтобы провести день в Йельском университете, в лаборатории профессора Джо Галла. В то время я еще только начинал понимать, какие возможности открывает исследователям микроскопическое создание тетрахимена, и мне захотелось посетить лабораторию Джо, потому что он недавно обнаружил у этой тетрахимены необычный набор генов, организованных в виде мини-хромосом, каждая из которых была меньше одной тысячной длины самой маленькой хромосомы человека. Эти отдельные молекулы ДНК содержали гены рибосомальной РНК тетрахимены. Несколько лет спустя с их помощью будет показан самосплайсинг РНК и впервые описана каталитическая функция РНК, но тогда ничего похожего на горизонте еще не маячило.
Я провел утро в лаборатории Джо, наблюдая в микроскоп, как тетрахимена мечется в капле, ограниченной предметным стеклом, пока не наступило время обеда. Коллеги Джо отвели меня в кафе на верхнем этаже Биологической башни Клайна, самого высокого здания в кампусе, дизайн которого явно не учитывал важность горизонтальных связей для взаимодействия и сотрудничества. Но нам всем гораздо интереснее было поговорить о науке, а не критиковать архитектуру. Группа Джо восхищалась исследованиями их австралийского постдокторанта Лиз Блэкберн.
Лиз выросла в Хобарте на острове Тасмания. С ранних лет она заразилась страстью к науке и, увлекшись биологией, прошла путь до аспирантуры Кембриджского университета. Там, работая с двукратным нобелевским лауреатом Фредом Сенгером, она секвенировала ДНК бактериального вируса – по тем временам это было прорывом. Когда после защиты диссертации она перебралась в Йельский университет, прежний опыт оказался очень полезен для ее новой необычной темы, и она быстро добилась прогресса в определении последовательности ДНК на концах мини-хромосом тетрахимены.
В то время Лиз не думала о новых направлениях в исследовании рака или процесса старения. Не подозревала она и о том, что откроет новую главу в науке о РНК. Ей казалось, что она просто расскажет еще одну историю про ДНК. Никто из нас не знал, какой может быть ДНК на концах хромосом – линейных молекул ДНК, хранящихся в клеточных ядрах большинства организмов.
Эти кончики хромосом, так называемые теломеры (в дословном переводе с греч. – «конечные части»), давно вызывали интерес у специалистов по биологии клетки, в частности у Германа Меллера, наблюдавшего за дрозофилами, и Барбары Мак-Клинток, работавшей с кукурузой. В 1938 г. и Мак-Клинток, и Меллер показали, что при разрыве хромосомы, возникшем в природе спонтанно или при воздействии рентгеновским излучением, концы хромосомы в месте разрыва становятся нестабильными и либо сливаются с другими обломанными концами, либо разрушаются. В то же время естественные концы хромосомы каким-то образом защищены от подобных проблем. Теломеры на концах хромосом похожи на эглеты – тонкие пластиковые наконечники шнурков, сохраняющие шнурки в целости и не дающие им распускаться. Но в течение последующих 40 лет никто не мог понять, что именно позволяет хромосомным теломерам служить как эглеты.
Тысячи лабораторий по всему миру занимались секвенированием центральных участков хромосом, тех, где располагались гены, а концы оставались почти совсем неизученными. Поэтому Лиз и Джо направили свои усилия туда. Что за ДНК на концах хромосом и как защищены эти концы? Было решено использовать мини-хромосому тетрахимены, поскольку ее 10 000 копий в клетке обеспечивают достаточно материала, чтобы можно было надеяться на успех.
На конце каждой мини-хромосомы тетрахимены Лиз обнаружила нечто очень странное – короткую шестибуквенную последовательность, которая повторялась много раз[180]. В одной нити повторялось ТТГГГГ, в другой повторялась комплементарная последовательность ЦЦЦЦАА:
ТТГГГГТТГГГГТТГГГГ…
ААЦЦЦЦААЦЦЦЦААЦЦЦЦ…
Это было все равно что читать роман и в конце вполне внятного предложения обнаружить «и т. д. и т. д. и т. д. и т. д. и т. д. и т. д. и т. д.». Одно «и т. д.» может иметь смысл, но длинная череда таких сокращений кажется совершенно излишней. Что это может значить?
Лиз и Джо сейчас широко известны тем, что впервые определили последовательность нуклеотидов в теломере. Но интересно, что в статье 1978 г., в которой они сообщали об открытии, слово теломера просто не упоминается. Авторы объявили, что впервые расшифрована теломерная последовательность, не назвав этого слова! К чему такая осторожность? Мини-хромосомы тетрахимены так необычны, они настолько меньше хромосом человека и представлены в таком большом количестве копий, что ученые сочли слишком самонадеянным утверждать, что теломеры больших, нормальных хромосом будут такими же. Так часто бывает в науке. Если ваша работа намного опередила свое время, далеко не сразу окружающие, да и вы сами сможете оценить ее значение.
Нужен был еще один решающий эксперимент, чтобы Лиз Блэкберн убедилась, что имеет дело именно с теломерами. В 1978 г. она перешла в Калифорнийский университет в Беркли на профессорскую должность, чтобы создать собственную лабораторию. На конференции в Нью-Гэмпшире в 1980 г. у Лиз завязался разговор с Джеком Шостаком, который тогда начал работать в Институте изучения рака Даны – Фарбера в Бостоне. Джек изучал хромосомы пекарских дрожжей. Он обнаружил, что если в клетки дрожжей ввести искусственные кольцевые молекулы ДНК, то они сохранятся там как мини-хромосомы, но введенные таким же образом линейные молекулы не выживали. Это казалось странным, потому что собственные хромосомы дрожжей – линейные молекулы, а не кольцевые.
Джек и Лиз задумались, не были ли эти линейные молекулы ДНК в дрожжах недолговечными из-за отсутствия на концах каких-то стабилизирующих элементов. Может быть, «шнуркам» нужны были эглеты. Единственными известными эглетами для ДНК были те, которые Лиз обнаружила на концах мини-хромосом у тетрахимены. Могут ли они выполнять такую же функцию и у дрожжей?
В 1982 г. Джек и Лиз совместно провели весьма дерзкий эксперимент. Они перенесли концевые участки ДНК тетрахимены – повторы ТТГГГГ – на концы фрагментов ДНК дрожжей. И догадка их оказалась верной. Кончики от ДНК тетрахимены позволяли поддерживать линейную ДНК в дрожжах в стабильном состоянии. Удивительный результат, учитывая огромную эволюционную дистанцию между этими организмами: тетрахимена так же далека от дрожжей, как и от человека.
Дженис Шампей, аспирантка из лаборатории Лиз, секвенировала концы линейной ДНК, которая теперь оставалась стабильной в дрожжах[181]. Результат мог оказаться незначительным. Она могла бы увидеть, что концы по-прежнему закрыты повторами ТТГГГГ, полученными от тетрахимены. Но обнаружилось нечто примечательное. Молекулы ДНК теперь заканчивались не «и т. д. и т. д. и т. д. и т. д. и т. д.», они заканчивались «и т. д. и т. д. и т. д. и т. д. и т. д. и т. п. и т. п. и т. п. и т. п.». Последовательность «и т. п.» оказалась той самой, которой дрожжи закрывают концы своих собственных полноразмерных хромосом. Это была собственная теломерная последовательность дрожжей[182]. Таким образом, хотя тетрахимена и дрожжи были совершенно разными видами, их теломерная последовательность оказалась достаточно похожей, чтобы дрожжи, обнаружив импортированную теломеру («и т. д.»), начали добавлять собственные теломерные повторы к концам мини-хромосомы.
Дженис, Джек и Лиз могли найти только один способ интерпретации результатов секвенирования. Повторяющаяся последовательность у тетрахимены «и т. д.» и у дрожжей «и т. п.» должна выполнять роль теломеров, придавая стабильность концам хромосом и не позволяя им разрушаться. Более того, у дрожжей обнаружился фермент, удлиняющий теломеры, который распознаёт повторы тетрахимены как «затравку» и добавляет к ним собственные последовательности. Это означало, что у тетрахимены тоже должен существовать удлиняющий теломеры фермент, который создает повторы своего типа. Все так красиво складывалось, но насколько это была устойчивая конструкция? Предположение будет подтверждено, если действительно удастся найти гипотетический фермент, удлиняющий теломеры. И новая аспирантка в лаборатории Лиз была готова взяться за эту задачу.
Кэрол Грейдер поступила в аспирантуру с трудом. Она страдала дислексией и неудачно сдавала стандартные экзамены. Но в отделении молекулярной биологии Калифорнийского университета в Беркли обратили внимание не только на результаты ее тестов, но и на ее исследования в колледже, которые были впечатляющими. Поэтому ей дали шанс[183]. Как оказалось, это было очень мудрым решением.
Кэрол, в свою очередь, была в восторге от возможности не только оказаться в Беркли, но и присоединиться к молодой лаборатории Лиз, где она взялась за амбициозное задание: выделить пока еще не обнаруженный фермент, удлиняющий теломеры у тетрахимены. Если фермент действительно существовал, то он должен был бы добавлять повторы ТТГГГГ к концам ДНК. Это было рискованное дело для начинающей аспирантки – найти то, чего еще никто не находил и чего может вообще не существовать. В то время Кэрол и представить себе не могла, что наградой ей будет не только ученая степень, но еще и возможность разделить Нобелевскую премию и заглянуть вглубь проблемы бессмертия.
Кэрол пришла в лабораторию к Лиз в мае 1984 г. Она сразу же начала выращивать тетрахимену в литровых стеклянных бутылках, вскрывать клетки и выделять из них ядра. Ведь удлинение теломер происходит в клеточном ядре, поэтому именно там, вероятно, следует искать фермент, катализирующий удлинение. Она замораживала и размораживала ядра, в результате чего они разрывались и содержимое их высвобождалось. Цель манипуляций состояла в том, чтобы выделить секретный ингредиент, удлиняющий концы хромосом после деления клетки.
Кэрол и Лиз решили, что для стимулирования активности фермента не обязательно наличие целой хромосомы, достаточно конца теломеры, где этот фермент работает. Поэтому Кэрол синтезировала короткие нити ДНК, состоящие из повторов ТТГГГГ (теломерная последовательность тетрахимены), надеясь, что этого хватит, чтобы фермент распознал теломеру и удлинил ее за счет дополнительных повторов. Затем она инкубировала эти искусственные теломеры в пробирках с разрушенными ядрами тетрахимены. К Рождеству 1984 г. Кэрол была в полном восторге, поскольку увидела, что ДНК удлиняется многократными повторами шестинуклеотидной последовательности ТТГГГГ. Она нашла прямое доказательство существования фермента, который позднее назовут теломеразой[184].
Как часто бывает в науке, едва найден ответ на один большой вопрос, сразу возникает следующий. Откуда белковый фермент может знать, как создать определенную последовательность ДНК длиной в шесть нуклеотидов? Такого фермента еще не находили. ДНК– и РНК-полимеразы способны синтезировать длинные последовательности нуклеотидов, но они это делают не самостоятельно, им нужна ДНК в качестве матрицы. Обратные транскриптазы вроде тех, что найдены у ретровирусов, используют РНК в качестве матрицы, чтобы синтезировать ДНК. Поэтому Кэрол и Лиз решили выяснить, существует ли РНК, служащая матрицей при добавлении последовательностей ТТГГГГ. Ведь с помощью комплементарности пар оснований РНК легко могла бы «запомнить» ТТГГГГ, надо было просто использовать А для обозначения Т и Ц для обозначения Г. Чтобы проверить предположение, Кэрол решила предварительно обработать препарат теломеразы тетрахимены рибонуклеазой – ферментом, расщепляющим РНК, и посмотреть, изменится ли что-нибудь.
В тот день в январе 1986 г., когда у Кэрол был эксперимент, я случайно оказался в Беркли, где проводил кафедральный семинар. Я встретился с Лиз и Кэрол утром, и Кэрол рассказала мне о своей идее проверить наличие РНК-компонента в теломеразе. Теперь, когда я был специалистом по РНК, меня взволновала возможность того, что РНК способна еще и на такой фокус. В течение дня, в перерывах между запланированными встречами с разными сотрудниками, я заглядывал к Кэрол в лабораторию и спрашивал, как продвигается эксперимент. И для меня, и для нее это была немного игра, поскольку на проведение такого опыта требуется минимум день, поэтому было маловероятно, что она будет сообщать мне что-то новое каждые полчаса[185].
Результаты эксперимента Кэрол я узнал, уже вернувшись в Боулдер. Она действительно обнаружила, что при обработке рибонуклеазой активность теломеразы нарушается. Большинство ферментов – белки, они не содержат РНК, и рибонуклеаза на них не действует. Но для работы теломеразы требовалась РНК[186]. Таким образом, теломераза оказалась еще одним исключением из правила, гласящего, что «все ферменты – белки». В этом списке исключений уже были наш рибозим тетрахимены, родственные ему самосплайсирующиеся РНК у других видов, рибонуклеаза Р и рибосомное устройство для синтеза белков. Теперь к приведенному перечню добавилась и теломераза.
Еще через несколько лет, в 1989 г., Кэрол удалось выделить и секвенировать РНК-компонент теломеразы тетрахимены. К тому времени она защитила диссертацию в Беркли и перешла в лабораторию Колд-Спринг-Харбор – знаменитый центр биологических исследований Джима Уотсона на берегу Лонг-Айленда. И надо же, оказалось, что РНК содержала участок ААЦЦЦЦ, который кодировал теломерную последовательность ТТГГГГ у тетрахимены[187]! Это подтвердило их с Лиз догадку, что РНК-матрица задает последовательность ДНК, добавляемую к концам хромосом.
Вскоре была идентифицирована и соответствующая человеческая РНК-теломераза, которая служит матрицей для похожей повторяющейся последовательности ТТАГГГ в теломерах человека[188]. Итак, РНК оказалась в центре еще одного жизненно важного процесса – формирования кончиков хромосом для сохранения целостности генома.
Все исследования теломер и теломеразы были вызваны любопытством, желанием на фундаментальном уровне понять, как работают хромосомы. Первоначально никакого медицинского применения полученных результатов не предполагалось. Но все изменилось, когда появились дополнительные данные о роли теломеразы в развитии рака и старении.
Теломераза использует короткий участок своей РНК в качестве матрицы для определения последовательности, которая будет добавлена к концу теломеры ДНК. Нуклеотиды добавляются по одному с помощью белка (серый овал). На рисунке показана теломерная последовательность тетрахимены ТТГГГГ. Когда теломерный повтор полностью сформирован, ДНК может проскользнуть вдоль РНК, освободив место для добавления следующего повтора (не показано)
Леонард Хейфлик родился в Филадельфии в 1928 г. и вырос там же. Ему было около десяти лет, когда он получил в подарок от дяди набор юного химика фирмы Gilbert и с благословения своих весьма наивных родителей организовал в подвале собственную лабораторию[189], где экспериментировал с изготовлением взрывчатых смесей и сооружением ракет. Учась в Пенсильванском университете, он открыл для себя биологию и в 1958 г. устроился на работу в исследовательский центр – Институт Вистара в Филадельфии. Там Хейфлик научился мастерски выращивать культуры человеческих клеток, например клеток легких без вирусов и рака, поэтому фармацевтическая промышленность была заинтересована в приобретении такого материала для производства вакцин, в частности от краснухи (немецкой кори).
При выращивании культур нормальных человеческих клеток рост их через некоторое время останавливался. Другие исследователи списывали такие случаи на неаккуратность в работе, а потому просто выбрасывали культуру и запускали новую. Хейфлик же был настолько выдающимся экспериментатором и скрупулезным наблюдателем, что понял значение происходящего. Нормальные человеческие клетки могут делиться ограниченное количество раз[190], обычно 50–60, а затем стареют. Состарившиеся клетки не умирали: они обретали другую форму, у них изменялся метаболизм, то есть они продолжали жить, но больше уже не делились. Сейчас мы говорим, что такие клетки достигли предела Хейфлика.
Сам Хейфлик всегда считал, что ограниченная продолжительность способности к делению у нормальных человеческих клеток вполне логична. Клеткам кожи, печени, костей и мозга необходимо делиться у эмбриона и у маленького ребенка, но у взрослого человека количество делений должно иметь предел. Это особенно важно потому, что альтернативный вариант – неограниченное деление – главная черта опухолевого процесса.
Но кто подсчитывает, через сколько делений уже прошла клетка? Должны существовать какие-то часы. Когда была открыта теломераза, возникло предположение, что такими часами может быть длина теломер и что она-то и обеспечивает предел Хейфлика. Поскольку теломераза не работает в большинстве клеток человеческого организма, неполная репликация теломер приводит к их укорачиванию, и таким образом запускается процесс старения. И напротив, у постоянно делящихся организмов, таких как тетрахимена и дрожжи, так же как и у раковых клеток, теломераза всегда работает, поддерживая длину теломер, и предел Хейфлика не будет достигнут никогда. В 1990 г. специалист по клеточной биологии Кел Харли, который тогда руководил лабораторией в Университете Макмастера в Канаде, привлек Кэрол Грейдер к проверке гипотезы об укорачивании теломер. Они провели исследование, имевшее большое значение, и обнаружили, что по мере старения определенного типа клеток человеческой кожи теломеры там неуклонно укорачиваются – примерно на 50 пар оснований за каждое деление клетки[191]. Корреляция была интригующей, но, как корректно заключили Кел и Кэрол, оставалось «неизвестно, является ли эта потеря ДНК причиной старения», то есть действительно ли клетки перестают делиться из-за этого.
Действительно ли теломераза – «фермент бессмертия», способствующий долгой жизни? А как же обнаруженные учеными доказательства, что повышенная активность теломеразы – характерная черта всех типов рака[192]? Означает ли это, что теломераза может быть хорошей мишенью при лечении рака? Из-за этих предполагаемых связей теломеразы со старением и раком биотехнологические и крупные фармацевтические компании начали охоту на белковую часть теломеразы, поскольку, как бы ни была важна теломеразная РНК, она может действовать только в сочетании со своим белковым партнером. Чтобы раскрыть секреты теломеразы, нужно было выделить всю систему вместе – РНК и белок, что было чрезвычайно сложно, поскольку даже в опухолевых клетках, где она оказывает такое страшное воздействие, теломеразы мало. Всего лишь щепотки этого ингредиента достаточно, чтобы клетки бесконечно продолжали свое деление. Для решения проблемы с очисткой теломеразы понадобился швейцарский постдокторант Йоахим Лингнер и маленькое создание из пруда – дальняя родственница тетрахимены.
Теломерная гипотеза старения. Человеческим клеткам необходима теломераза для сохранения длины теломер. В большинстве соматических клеток нет теломеразы, поэтому в процессе деления клетки теломеры укорачиваются. Когда теломеры становятся слишком короткими, клетка перестает делиться и стареет. Восстановление активности теломеразы – одно из условий возникновения опухоли. Опухолевые клетки бессмертны и всегда способны к делению
Швейцарский Базель – фантастический город на Рейне. Около этого города Швейцария встречается с Германией и Францией. Это город великолепных художественных музеев – на фоне бетонных стен демонстрируются грандиозные картины Ротко с ошеломительными красками. Пять мостов перекинуты через Рейн, а между ними курсируют четыре городских парома Wilde Maa, Leu, Vogel Gryff и Ueli, позволяющие пересечь реку, не используя никаких моторов. Паромы гениально сконструированы: они используют естественную силу течения, чтобы пересечь реку в одном направлении, а затем руль поворачивают – и то же течение обеспечивает движение в обратную сторону. Не менее гениальны и научные исследования, которые выполняются в Базеле – в Базельском университете, Институте биомедицинских исследований имени Фридриха Мишера и двух ведущих мировых фармацевтических компаниях – Roche и Novartis.
В 1992 г. я приехал в биоцентр Базельского университета, чтобы провести научный семинар. Во время визита я познакомился с аспирантом Йоахимом Лингнером, который заканчивал диссертацию под руководством одного из ведущих швейцарских специалистов в области РНК[193]. Йоахим спросил, можно ли ему приехать в Боулдер, чтобы заняться выделением теломеразы. Предполагалось, что этот фермент содержит РНК-элемент, как показали Кэрол и Лиз. Также предполагалось, что у него обнаружатся один-два белковых компонента, участвующие в процессе удлинения ДНК. В 1993 г. я пригласил Йоахима в Боулдер и заверил его, что мы сможем добиться успеха там, где все компании потерпели неудачу, если будем работать с организмом, обладающим при удлинении теломер поразительной производительностью.
Я выбрал окситриху (Oxytricha nova) – существо, которое вместе с тетрахименой обитает в прудовом иле по всему миру. Я узнал про окситриху от своего коллеги Дэвида Прескотта, который выделил множество одноклеточных организмов из пруда на территории нашего университетского кампуса. Дэвид обнаружил нечто невероятное: у окситрихи было 100 млн мельчайших хромосом, в каждой из которых содержалось всего по одному гену. Поскольку у каждой хромосомы было два конца, в каждой клетке имелось 200 млн теломер. Для сравнения: у человека в большинстве клеток тела по 23 пары хромосом, то есть всего 46 хромосом, или 92 теломеры. Если предположить, что количество теломеразы будет зависеть от количества теломер, окситриха даст нам в миллионы раз больше шансов, чем было у исследовательских групп тех компаний, которые пытались выделить теломеразу из опухолевых клеток человека.
Подобно многим другим «ценным идеям», продвигаемым научными руководителями, мой план содержал некоторые недочеты. Как вскоре обнаружил Йоахим, окситриху сложно культивировать. Мы выращивали ее в открытых поддонах, предназначенных для выпечки лазаньи и купленных в местном универсаме сети King Soopers. Животные ползали вблизи дна, охотясь за бактериями и водорослями. Отделять простейших от их живой пищи было утомительно, поэтому Йоахим решил переключиться на другой вид, а именно на родственницу окситрихи эуплотес (Euplotes aediculatus), которая была столь огромна по микробным меркам (почти различима невооруженным глазом), что застревала в марлевом фильтре, когда бактерии и водоросли проходили насквозь. На содержание этих созданий все еще требовалось много времени, поэтому для их разведения мы пригласили студентов Колорадского университета. Студенты выращивали водоросли, чтобы кормить этих инфузорий, проверяли их под микроскопом, убеждаясь, что у них все в порядке, и по мере роста популяции рассаживали их в новые противни для лазаньи.
Но как выделить из этих тварей теломеразу? Йоахим решил выделить РНК-субъединицу теломеразы и использовать ее в качестве «ручки», чтобы вытащить за нее весь фермент. При помощи одного из студентов он смог успешно выделить и секвенировать ген РНК-субъединицы теломеразы эуплотесов[194]. Оказалось, что эта РНК была похожа на РНК тетрахимены, но не идентична ей. Обнаружилось именно то, что мы предполагали: поскольку эти две РНК выполняли одинаковую биологическую задачу, но у разных видов, они адаптировались и изменились в процессе длительной эволюции. Йоахим решил выудить теломеразу во вскрытых клетках эуплотесов, используя в качестве наживки короткий участок ДНК, комплементарный матричному участку в РНК-субъединице. ДНК-наживка должна была связываться с матричной РНК в теломеразе за счет комплементарности, и затем он мог бы вытащить из сложной смеси клеточных веществ эту РНК вместе с присоединенными к ней белка́ми, за которыми он охотился. Это превосходно сработало. Когда биохимикам надо предотвратить разрушение нежных ферментов, они работают в холодной комнате, аналогично тому, как мы храним нашу еду в холодильнике. Год, проведенный в такой холодной комнате, – и Йоахим стал первым, кто сумел выделить из Euplotes aediculatus теломеразу в чистом виде[195].
К сожалению, у нас было очень мало очищенной теломеразы Euplotes, всего около 10 микрограммов. А микрограмм – это одна миллионная доля грамма, и даже грамм – это всего лишь вес одной изюминки. У нас был только один шанс определить последовательность аминокислот этого драгоценного материала, иначе пришлось бы еще на несколько месяцев вернуться в холодную комнату. Поэтому нам нужен был коллега с квалификацией мирового уровня. Весной 1996 г. мы связались с работавшим в Европейской молекулярно-биологической лаборатории в Гейдельберге Маттиасом Манном, который только что изобрел новый метод определения последовательности белков и хотел проверить его на белке с неизвестной структурой. Мы отправили ему нашу уникальную теломеразу, и вскоре он прислал нам 14 фрагментов аминокислотных последовательностей белка теломеразы эуплотес. Для Йоахима этой информации было более чем достаточно, чтобы выделить соответствующий ген.
Для выделения теломеразного белка использовали особенности его РНК-партнера. «Приманкой» была нуклеиновая кислота с последовательностью, комплементарной РНК теломеразы, это позволило отделить РНК со связанным белком (серый овал) от других компонентов клетки
Среди биотехнологических компаний, увлекшихся изучением связи между теломерами и старением, была корпорация Geron (название происходит от того же корня, что и «геронтология»), расположенная в Менло-Парке в Калифорнии. Ее сотрудники упорно работали над выделением человеческой теломеразы из опухолевых клеток, но обнаружили, что это очень сложная задача. И вот в августе 1996 г. они организовали в отеле Hapuna Beach на побережье Кона Большого острова Гавайев четырехдневный симпозиум по теломеразе и раку. Возможно, устроители надеялись, что участники конференции, расслабившись под действием очаровательного места в тропиках и нескольких коктейлей, разболтают какую-нибудь важную информацию об этом неуловимом белке, который в совокупности с РНК образует теломеразу.
На симпозиуме за чашкой кофе я завел разговор со своей старой знакомой Вики Лундблад, которая тогда была профессором Медицинского колледжа Бейлора в Хьюстоне. Вики была одной из моих студенток в те времена, когда я в должности ассистента преподавателя вел лабораторные занятия по общей химии в Калифорнийском университете в Беркли. Позже она стала аспиранткой Джека Шостака, потом постдокторантом у Лиз Блэкберн. Вики хотела постичь фундаментальные механизмы сохранения кончиков хромосом у дрожжей. Любопытно, что она как раз тогда описала два новых дрожжевых гена, при выключении которых теломеры у дрожжей делались всё более короткими. Соответственно, Лиз назвала эти открытые ею гены аббревиатурой Est[196] (от англ. Ever shorter telomeres – «еще более короткие теломеры»).
Дрожжи – одноклеточные организмы. Обычно они бесконечно размножаются, и теломераза их всегда активна. В этом смысле они похожи на человеческие стволовые или опухолевые клетки, которые тоже делятся снова и снова. Результаты, полученные Вики с генами Est, вероятно, можно объяснить тем, что они кодируют критически важные фрагменты теломеразы. В случае инактивации этих генов теломеры дрожжей укорачивались при каждом делении клетки, что приводило к клеточному старению. Последовательность нуклеотидов в генах Est не совпадала ни с чем наблюдаемым ранее, поэтому Вики не понимала, куда двигаться дальше. Я рассказал ей про наши результаты с эуплотесами, и мы подумали, не охотимся ли за одной и той же добычей. Мы говорили об обмене генетическими последовательностями, а тем временем рядом с нами очень медленно наливала себе кофе Тития де Ланге, знаменитая исследовательница теломер из Рокфеллеровского университета. Она предложила нам встретиться – ей было интересно узнать, что из этого выйдет.
Пока мы с Вики были на Гавайях, Йоахим в Боулдере сделал поразительное открытие. Глядя на последовательность аминокислот в новом теломеразном белке эуплотесов, он испытал странное ощущение дежавю. Раньше он уже видел эту последовательность или, по крайней мере, нечто очень на нее похожее в знаменитой обратной транскриптазе – ферменте вируса иммунодефицита человека. Почему наш теломеразный белок похож на важнейший белок такого вируса, как ВИЧ? Чем больше Йоахим об этом размышлял, тем логичнее ему это казалось. Теломераза, как и ВИЧ, должна использовать РНК-матрицу для синтеза ДНК, и обратная транскриптаза обеспечивает этот процесс.
Вернувшись с Гавайев, я связал Йоахима со студентом Вики из Бейлора Тимом Хьюзом. Нашей целью было сравнить генетические последовательности эуплотесов и дрожжей и понять, есть ли смысл дальше работать совместно. И да, смысл был. Белок дрожжей Est2 явно совпадал с нашим белком, выделенным из эуплотесов, особенно в той области, которая была похожа на обратную транскриптазу. Но в отличие от эуплотесов, для которых не существовало никаких молекулярно-генетических инструментов, у дрожжей мы могли подставить несколько версий гена и посмотреть, какие работают, а какие нет.
Началось чрезвычайно интенсивное сотрудничество. Мы сделали дрожжевые гены белка Est2 с мутациями в участке, в котором Йоахим узнал обратную транскриптазу. Помню, как однажды днем я зашел в лабораторию и увидел, что один из моих научных сотрудников держит в руках конверт почты Federal Express, а Йоахим складывает туда пробирки с ДНК. Он отнес пакет вниз, чтобы успеть к последней отправке почтовой службы. Пробирки доставили в Хьюстон для анализа теломер.
Через несколько месяцев все стало ясно. При замене хотя бы одной аминокислоты в той части белка Est2, которая, предположительно, обеспечивала удлинение теломер, происходило укорачивание теломер дрожжей и старение клеток. Они старели бесконтрольно, прямо у нас на глазах. Таким образом, белок Est2, открытый Вики, и, следовательно, наш белок, выделенный из эуплотес, были необходимы для удлинения теломер в живых клетках.
Обнаружить некоторые секретные ингредиенты, предотвращающие процесс старения, было весьма волнующей задачей, но наши открытия, по крайней мере на тот момент, ограничивались дрожжами и прудовым илом. Применимы ли эти знания к людям? Для проверки взаимосвязи между теломеразой, старением и опухолью требовался белок человеческой теломеразы – обязательный партнер той РНК, которую открыли Кэрол и Лиз.
Шли первые годы реализации проекта «Геном человека», когда ежедневно и довольно бессистемно публиковались новые последовательности ДНК. Незадолго до выхода нашей статьи в журнале Science[197] у нас на экране лабораторного компьютера появился неидентифицированный фрагмент последовательности ДНК человека, в значительной степени соответствовавший последовательностям, кодирующим белки теломеразы у эуплотесов и дрожжей. Это был шанс найти белок теломеразы человека. Но как только выйдет наша статья, другие, несомненно, тоже обнаружат это сходство. У нас было всего несколько недель преимущества, чтобы успеть выделить ген человека. Гонка началась!
Одну из групп охотников за геном теломеразы возглавлял известнейший мировой специалист по опухолям биолог Боб Вайнберг из Института Уайтхеда при Массачусетском технологическом институте. Волею судьбы я оказался в совете по научным вопросам Института Уайтхеда. На ежегодном выездном семинаре в Белых горах в Нью-Гэмпшире я разговорился с постдокторантами Вайнберга Крисом Каунтером и Мэттом Мейерсоном возле их стенда и узнал, что они близко подобрались к гену теломеразы человека. Я обронил что-то вроде «Может быть, вам найти другую тему, потому что это мы уже сделали?». Не очень мудро говорить такое двум исключительно талантливым и чрезвычайно амбициозным исследователям, которые сразу же удвоили свои усилия.
В итоге моя лаборатория выиграла ту гонку, но с небольшим отрывом. Наша статья с описанием гена теломеразы человека TERT (от telomerase reverse transcriptase – теломеразная обратная транскриптаза) вышла в Science 15 августа 1997 г.[198] Группа Боба Вайнберга опубликовала прекрасную статью о гене TERT человека[199] на неделю позже. И действительно, при смешивании РНК-субъединицы с белком TERT образовывалась теломераза, работающая и в пробирке, и в живых клетках[200].
Имея в руках оба компонента теломеразы человека, РНК и белок, можно было наконец проверить, действительно ли именно от теломеразы зависит, будут или нет запущены молекулярные часы, ограниченные пределом Хейфлика. Первыми учеными, получившими долгожданный ответ, были профессор Вуди Райт и его коллеги из Юго-Западного медицинского центра Техасского университета в Далласе в сотрудничестве с учеными из корпорации Geron. Они ввели активный ген белка TERT в нормальные клетки сетчатки человека, про которые известно, что РНК-субъединица теломеразы в них уже есть, а белка TERT нет, и теперь клетки могли делиться неограниченно[201]. В то же время клетки сетчатки без TERT прекращали делиться и демонстрировали признаки старения после 50–60-й теломеры – та самая линейка, с помощью которой задается предел Хейфлика, а предотвращает старение активная теломераза. Такой метод теперь используют в биомедицинских исследованиях и промышленности для предотвращения старения культуры человеческих клеток при выращивании в термостатах. Если надо, чтобы клетки человека в вашей культуре неограниченно делились, просто введите ген TERT.
Свойство теломеразы делать клетки человека бессмертными и непрерывно поддерживать в лабораторных условиях их способность к делению без признаков старения – научный факт. Но, к сожалению, из него сделали вывод, что повышение содержания теломеразы может увеличить продолжительность жизни человека. Это некорректное упрощение – думать, что если наши клетки не умрут, то и мы не умрем. Вернемся к моей полке с безделушками, где лежат теломерные кремы, «продлевающие жизнь», и таблетки, «активирующие теломеразу», для которых «клинически доказано удлинение теломер». Поскольку в составе этих таблеток и кремов натуральные растительные компоненты, их можно продавать как биологически активные добавки, не проводя плацебо-контролируемых клинических исследований, которые требует Администрация по контролю за продуктами питания и лекарственными препаратами. То есть на самом деле их эффект не был «клинически доказан».
Однако давайте на минуту представим, что эти таблетки и кремы работают так, как заявлено в рекламе. Что было бы, если бы они действительно не давали нашим теломерам укорачиваться, а клеткам стареть? Это было бы хорошо? Чрезвычайно сложно предположить, что было бы, если бы все наши клетки непрерывно делились. Но мы все-таки попытаемся. Одним из следствий могли бы быть очень крупные люди, которые непрерывно увеличивались бы в размерах. Или, с учетом связи между безостановочным делением клеток и онкологическим процессом, возможно, эти гипотетические люди с теломеразной активностью погибали бы от гигантской опухоли.
Поэтому, чтобы принести пользу, надо аккуратно обращаться с активностью теломеразы и величиной теломер. Если мы когда-нибудь придумаем, как использовать эти исследования на практике, следует предвидеть две ситуации, в которых они могли бы спасти жизни людей.
Первая касается наших стволовых клеток, задача которых – восполнять поврежденные клетки в нашем организме, поэтому они должны продолжать деление на протяжении всей жизни. Изредка рождаются люди с очень короткими теломерами – они меньше, чем у сверстников, на 99 процентов. В результате уже после незначительного укорачивания теломер стволовые клетки таких людей достигают старости и больше не могут поддерживать жизненно важные ткани. Именно в этом причина такого наследственного заболевания, как врожденный дискератоз. У больных наблюдаются аномальная пигментация кожи, деформированные ногти на руках и ногах, поражения полости рта, проблемы с зубами; в дальнейшем многие из них умирают от анемии. Как выяснилось, причиной дискератоза становится мутация в гене какого-либо из компонентов теломеразы, в результате чего клетки, которые должны продолжать делиться, вместо этого стареют. Точно так же многие случаи распространенного заболевания крови – апластической анемии и мучительного заболевания легких – легочного фиброза – возникают из-за недостаточного количества теломеразы и, как следствие, укорочения теломер. Всем этим людям очень бы пригодился безопасный способ удлинить теломеры в их стволовых клетках. Если бы нам удалось создать препарат, который действительно активировал бы теломеразу, следующей задачей было бы нацелить его преимущественно на стволовые клетки.
Вторая ситуация – обратная сторона первой. Большинство опухолевых клеток первоначально были нормальными клетками всего с несколькими роковыми мутациями, из-за которых они начали стремительно делиться. В 90 процентах случаев онкологических заболеваний человека теломераза также активируется – и клетки становятся практически бессмертными. Приведу лишь один пример того, насколько живучи эти опухолевые клетки. Первая линия бессмертных клеток, полученных из опухоли знаменитой онкологической пациентки Генриетты Лакс в Балтиморе в 1951 г., – клетки HeLa. В них активна теломераза, и спустя 70 лет они все еще живы в тысячах лабораторий по всему миру. Подсчитано, что если все когда-либо выращенные клетки HeLa расположить в ряд, то они растянутся более чем на 100 000 километров. Этого достаточно, чтобы трижды обернуть Землю[202].
Учитывая, сколь ужасающую силу приобретают опухолевые клетки благодаря теломеразе, перспективно было бы найти способ не активировать, а подавлять теломеразу в опухолях или вообще изначально предотвратить ее активацию. Но для этого ученым надо было разгадать еще одну загадку: откуда вообще берется в опухолях активная теломераза?
К началу 2000-х гг. ученые во всем мире секвенировали ген TERT в опухолях, но не могли найти мутации, объясняющие, как TERT включается. Так продолжалось до тех пор, пока не появился Франклин Хуанг.
Франклин, сын тайваньских иммигрантов, вырос в Оклахоме. Он получил медицинское образование и защитил диссертацию в Гарвардской медицинской школе, а в 2012 г. как медик начал работать в лаборатории Леви Гаррауэя в Институте исследования рака Даны – Фарбера в Бостоне. Леви использовал для секвенирования опухолевой ДНК новую мощную технологию компании Illumina и был лидером в этой области исследований. Сотрудники его лаборатории искали мутации, которые могли быть причинами развития опухоли и мишенями для фармакологического вмешательства.
Лаборатория располагала обширной коллекцией геномных последовательностей при меланоме, благодаря чему уже была получена полезная информация про этот рак кожи. Однако Франклин взглянул на эти данные под новым ракурсом. Он быстро понял, что в гене TERT происходит нечто необычное. В 17 из 19 образцов меланомы в одной и той же позиции была обнаружена замена одной пары оснований. И этот сбой отмечался не в кодирующем участке, на котором фокусировались все исследователи, а в промоторе – области, запускающей транскрипцию мРНК с ДНК. Было похоже, что при замене нуклеотида возникает участок связывания для транскрипционного фактора – белка, который активирует транскрипцию гена. Возможно, именно из-за этой генетической ошибки начинала синтезироваться теломераза и рак получал простор для развития?
Коллеги Франклина по лаборатории были настроены скептически. Они считали практически невозможным, что одна и та же вызывающая рак мутация возникает с такой высокой частотой. Может быть, это погрешность исследования? Может быть, у высокотехнологичного секвенатора ДНК возникли сложности с этой конкретной последовательностью и он часто прочитывает ее неправильно[203]?
Тогда Франклин определил последовательность ДНК старым методом, без использования высокотехнологичного секвенатора, чтобы избежать его ошибок, если они действительно были. На это ушла вся ночь, но уже на следующий день он получил ответ. У большинства меланомных ДНК-последовательностей действительно была мутация в гене TERT в той самой позиции, где он уже наблюдал ее ранее. Более того, когда он секвенировал ДНК не из опухолевой ткани, а из крови тех же пациентов, то обнаружил, что ни у кого не было этой мутации в гене TERT. Иначе говоря, мутация была характерна именно для раковых клеток, и, следовательно, это было не ошибкой секвенирования ДНК, а реальным фактом.
Затем Франклин и Леви показали, что выявленная однонуклеотидная замена действительно запускает транскрипцию гена TERT. Позже они и другие исследователи обнаружили, что многие типы опухолей тоже используют этот удобный для них прием[204], активируя TERT и таким образом запуская синтез теломеразы, причем с помощью той же самой мутации. Весьма примечательно, что данная мутация независимо возникает постоянно, по всему миру, сотни тысяч раз за год. Вероятно, с такой же частотой возникает и множество других мутаций, но они не приводят к развитию опухоли, а потому остаются незамеченными в дальнейшем.
Открытие, о котором идет речь, очень важно для диагностики. Для многих типов опухолей наличие мутации в промоторе TERT означает более агрессивное течение заболевания[205], и, соответственно, чтобы пациент выжил, требуется более агрессивное лечение. Поэтому проверка на присутствие отмеченной мутации помогает врачам скорректировать план лечения; возможно, если мутация не выявляется в опухоли, будет рекомендовано более мягкое лечение, позволяющее избежать некоторых изнуряющих побочных эффектов химиотерапии.
Уже сейчас информация о мутации помогает пациентам, поскольку ее применяют для диагностики, но хотелось бы использовать ее и для эффективного лечения. Однако тут есть несколько проблем. Одна из них – как подавить активность теломеразы в опухолях и при этом сохранить в стволовых клетках, где она необходима. Как и во всех наших историях, связанных с РНК, знание биологии и понимание генетических механизмов необходимы для медицинского вмешательства, хотя не гарантируют его успешность. Зачастую между научным открытием и его использованием для лечения лежит долгий и сложный путь, и в случае с теломеразой он еще не пройден.
Следующая тема в нашей истории РНК – это РНК-интерференция. Здесь переход от фундаментального открытия к терапевтическому применению произошел значительно быстрее. Отчасти фундаментальные исследования так важны и так интересны, потому что, когда мы узнаём новое о природе РНК, никогда нельзя предугадать, какое этому найдется медицинское применение.