Принцип метода

Мочевина образует с диацетилмонооксимом в сильнокислой среде в присутствии тиосемикарбазида и ионов трехвалентного железа красный комплекс.

Необходимые реактивы

1. Трихлоруксусная кислота, 100 г/л.

2. Диацетилмонооксим, 25 г/л водный раствор. Реактив стабилен.

3. Тиосемикарбазид, 2,5 г/л водный раствор. Для приготовления реактива можно пользоваться также тиосемикарбазида гидрохлоридом; последний применяется в виде 3,2 г/л водного раствора.

Оба реактива стабильны при хранении в темной посуде при комнатной температуре.

4. Серная кислота концентрированная.

5. Ортофосфорная кислота 85%-ная.

6. Хлорное железо. Основной раствор хлорного железа: 5 г хлорного железа доводят до 100 мл водой и подкисляют добавлением 1 мл концентрированной серной кислоты. Из основного раствора готовят рабочий раствор хлорного железа: 1 мл основного раствора хлорного железа доводят до 100 мл водой, затем добавляют 8 мл концентрированной серной кислоты и 1 мл 85%-ной ортофосфорной кислоты. Хранят в темной посуде. Годен в течение 2 недель.

7. Бензойная кислота, 2 г/л. 0,2 г кристаллической бензойной кислоты растворяют в 100 мл воды при интенсивном перемешивании на водяной бане.

8. Мочевина для приготовления калибровочного раствора. Готовят 7 ммоль/л раствор мочевины: 42 мг мочевины растворяют в воде в мерной колбе вместимостью 100 мл. В качестве растворителя можно использовать 2 г/л раствор бензойной кислоты. Калибровочный раствор, приготовленный на растворе бензойной кислоты, стабильнее, чем водный; 1 мл калибровочного раствора содержит 0,007 ммоль мочевины.

9. Цветной реактив: к 30 мл рабочего раствора хлорного железа добавляют 20 мл воды, 1 мл 25 г/л раствора диацетилмонооксима и 0,25 мл 2,5 г/л раствора тиосемикарбазида. Цветной реактив готовят каждый раз перед употреблением.

Ход определения мочевины в сыворотке крови

Опытная проба: в центрифужную пробирку наливают 0,8 мл воды, 0,2 мл сыворотки и 1 мл 100 г/л раствора трихлоруксусной кислоты, смешивают. Через 15–20 мин центрифугируют. В чистую пробирку вносят 0,5 мл надосадочной жидкости и 5 мл цветного реактива. Пробирку выдерживают на кипящей водяной бане в течение 20 мин, затем охлаждают в течение 2–3 мин под проточной водой. Измерение проводят на фотометре при длине волны 530–560 нм (зеленый светофильтр) против холостой пробы в кювете с толщиной слоя в 1 см. Холостую пробу ставят так же, как опытную, но вместо надосадочной жидкости берут 0,5 мл воды.

Расчет проводят по формуле путем сравнения с калибровочной пробой. Калибровочную пробу ставят аналогично опытной, но вместо сыворотки берут 0,2 мл калибровочного раствора.

Концентрация мочевины, ммоль/л:

Е_оп/ Е_к× С_к,

где Е_оп – экстинкция опытной пробы;

Е_к – экстинкция калибровочной пробы;

С_к – концентрация мочевины в калибровочном растворе, 7 ммоль/л.

Определение мочевины в моче проводят аналогично определению мочевины в сыворотке крови, но вместо сыворотки берут 0,2 мл разведенной мочи. Параллельно обрабатывают калибровочную пробу, как описано для определения мочевины в сыворотке крови.

Расчет мочевины на суточное количество мочи производят по следующей формуле:

М_сут= С_к× Е_оп× а × К / Е_к× б,

где М_сут – количество мочевины в суточной моче, ммоль;

Е_оп – экстинкция опытной пробы;

Е_к – экстинкция калибровочной пробы;

С_к – содержание мочевины в калибровочном растворе, ммоль;

а – суточное количество мочи, мл;

б – количество мочи, взятое на анализ, мл;

К – коэффициент разведения мочи.

Примечания

1. Измерение проводят не позже чем через 15 мин после охлаждения проб ввиду неустойчивости окраски.

2. Из-за неустойчивости окрашенного комплекса мочевины с диацетилмонооксимом и зависимости окраски от условий нагревания калибровочную пробу определяют параллельно каждой серии опыта.

3. При содержании мочевины в сыворотке крови выше 17 ммоль/л сыворотку разводят изотоническим раствором хлорида натрия, а результаты умножают на коэффициент разведения.

4. Для пересчета на азот мочевины результаты следует разделить на 2,14.