Принцип метода
Порфобилиноген (ПБГ) реагирует с парадиметиламинобензальдегидом с образованием окрашенного в красный цвет соединения. Для повышения специфичности реакции добавляют ацетат натрия. Соединения, дающие аналогичную реакцию с парадиметиламинобензальдегидом (уробилиноген, производные индола, скатола и др.), удаляют путем экстракции хлороформом и бутанолом, в которых ПБГ нерастворим.
Необходимые реактивы
1. 4-(диметиламино)-бензальдегид (парадиметиламинобензальдегид).
2. Соляная кислота концентрированная.
3. Реактив Эрлиха: 0,7 г парадиметиламинобензальдегида растворяют в 150 мл концентрированной НСl, приливают к 100 мл дистиллированной воды и смешивают. Раствор должен быть бесцветным или слегка желтым. Хранят в посуде из темного стекла. Реактив стабилен.
4. Натрия ацетат, насыщенный раствор: 375 г CH3COONa × 3Н2О (или 226 г CH3COONa) растворяют в 250 мл теплой дистиллированной воды, охлаждают до комнатной температуры. Хранят при температуре 20 °С. Раствор должен быть бесцветным и прозрачным.
5. Хлороформ.
6. Бутиловый спирт.
7. Бумага индикаторная для измерения рН (в интервале 4,0–5,0).
Ход исследования
Исследуют мочу в первые 2–3 ч после мочеиспускания. Смешивают в пробирке 2,5 мл реактива Эрлиха и 2,5 мл мочи. Добавляют 5 мл насыщенного раствора ацетата натрия и перемешивают. Измеряют рН индикаторной бумагой; рН должен быть в интервале 4,0–5,0.
Если рН меньше 4,0, то добавляют раствор ацетата натрия до установления нужного рН. Если окраска не развивается, результат считают отрицательным. При развитии розовой или красной окраски к пробе добавляют 5 мл хлороформа и встряхивают. Если окраска переходит в слой хлороформа, а верхний слой остается бесцветным или слегка желтоватым, то результат следует считать отрицательным. Если окраска остается в слое над хлороформом, то 6–8 мл из окрашенного слоя переносят в другую пробирку, добавляют бутиловый спирт в соотношении 1 : 2 и встряхивают. Если фазы не сразу разделяются, то смесь центрифугируют при переходе окраски в слой бутилового спирта – результат отрицательный, если же окраска остается в исследуемом слое, то в исследуемой моче концентрация ПБГ превышает нормальную.
Если концентрация ПБГ в моче нормальна (до 2 мг/л), то проба отрицательная. ПБГ данным методом обнаруживают при концентрации выше 6 мг/л.
При хранении мочи более 3 ч при комнатной температуре положительная реакция может стать отрицательной. Это можно объяснить превращением порфобилиногена в порфирин и образованием ингибиторов реакции. Если нет возможности исследовать мочу в первые 2 ч, то хранить ее надо в холодильнике при 4 °С, доведя рН мочи до 6,0–7,0, так как в этих условиях порфобилиноген стабилен длительное время.
Кровь можно обнаружить в моче микроскопически (см. «Микроскопия осадка мочи») и с помощью химических реакций.
Принцип методов
Каталитическое свойство гемоглобина и окисление веществ в присутствии окислителей (перекись водорода, озонированного скипидара и др.) с образованием цветной реакции.
Необходимые реактивы
1. Основной бензидин.
2. Раствор уксусной кислоты 50%-ный, перед употреблением немного бензидина (на кончике ножа) растворяют в 5 мл уксусной кислоты.
3. Раствор перекиси водорода 3%-ный или (лучше) пергидроль, разведенный в 10 раз.
Ход исследования
К 3–5 мл мочи добавляют 2–3 капли раствора бензидина в уксусной кислоте и столько же перекиси водорода, перемешивают. Положительная реакция на кровь дает зеленое или сине-зеленое окрашивание в течение первых 2 мин. Окрашивание, наступившее после 2 мин, не учитывается. Вместо перекиси водорода можно пользоваться перекисью бария. 0,025 г основного бензидина и 0,1 г перекиси бария растворяют в 5 мл 50%-ной уксусной кислоты. Реактив готовят непосредственно перед употреблением.
Ход исследования
К 3–5 мл мочи добавляют 2–4 капли реактива, отмечают изменение цвета в первые 2 мин. В положительном случае появляется сине-зеленое окрашивание.
Бензидиновая проба считается наиболее чувствительной.
Необходимые реактивы
1. Ледяная или 80%-ная уксусная кислота.
2. Спирт 96%-ный.
3. Эфир.
4. Свежеприготовленная гваяковая настойка: растертую в порошок гваяковую смолу, взятую на кончике ножа, всыпают в сухую пробирку, приливают 2–6 мл спирта, дают отстояться, для реакции берут отстоявшуюся жидкость без осадка.
5. 3%-ная перекись водорода.
6. Хлороформ.
Ход исследования
3–5 мл мочи разводят уксусной кислотой и приливают равное количество эфира, тщательно размешивают и сливают в пробирку. Дают отстояться. Эфирный слой переносят в другую чистую пробирку, приливают 15–20 капель гваяковой настойки, 10–15 капель перекиси водорода. При наличии крови тотчас или через 1–3 мин появляется синее или фиолетовое окрашивание.
Небольшое количество мочи наносят на бумажный фильтр, положенный на чашку Петри. На него накапывают поровну (по 2–3 капли) уксусной кислоты, гваяковой настойки и перекиси водорода. В присутствии крови появляется сине-зеленое окрашивание.
Необходимые реактивы
1. 5%-ный спиртовой раствор пирамидона (амидопирина).
2. 30%-ный раствор уксусной кислоты.
3. Перекись водорода.
Ход исследования
Берут равные количества мочи и раствора пирамидона (по 2–3 мл), прибавляют по 10–12 капель уксусной кислоты и перекиси водорода.
В присутствии крови появляется сине-фиолетовое окрашивание. Интенсивность и время появления окраски зависят от количества крови. Отрицательный ответ дается через 2–3 мин.
Для диагноза гемоглобинурии необходимо доказать наличие гемоглобина в моче одной из химических проб.
При отсутствии эритроцитов в осадке (при микроскопическом исследовании) желательно спектроскопически определить природу пигмента.
Необходимые реактивы
1. 5%-ный раствор соляной кислоты.
2. 2–5%-ный водный раствор железисто-синеродистого калия (желтая кровяная соль).
Ход исследования
Центрифугируют 15 мл мочи. К осадку прибавляют несколько капель соляной кислоты и несколько капель железисто-синеродистого калия. Делают препарат и микроскопируют. Через 2–5 мин (возможно и раньше) в клетках в положительном случае видны сине-зеленые зернышки. При разрушении клеток гемосидерин лежит свободно.
Гемосидерин в моче встречается главным образом при гемолитических анемиях с внутрисосудистым гемолизом (болезнь Маркиафава—Микели и др.).
Исследование мочи на порфирины связано со значительными техническими трудностями.
Большая часть качественных проб и количественных методов определения основывается на их свойстве флюоресцировать при ультрафиолетовом свете.
Необходимый реактив
Кристаллический сульфат аммония.
Ход исследования
В 5 мл мочи растворяют 2,8 г кристаллического сульфата аммония и фильтруют. Если фильтрат имеет красно-коричневый цвет, то в моче имеется миоглобин (миоглобинурия); если цвет фильтрата нормальный, следовательно, в моче присутствовал гемоглобин, 80% которого осаждается реактивом.
Миоглобинурии встречаются при тяжелых травмах мышц, электротравмах, тяжелых миозитах и др.
В нормальной моче индикан содержится в незначительном количестве, которое не обнаруживается обычными качественными пробами.
Индиканурия встречается при интенсивном гниении белковых веществ в кишечнике (колит, непроходимость кишечника, рак, абсцесс кишечника, перитонит, запоры и пр.), а также при усиленном распаде белков в организме (опухоль, эмпиема, абсцессы и др.).
Принцип метода
Превращение индикана в индоксил минеральной кислотой и последующее окисление индоксила (хлорным железом или марганцовокислым калием) в индиго синее или красное.
Необходимые реактивы
1. Соляная кислота концентрированная.
2. Хлороформ.
3. 2%-ный раствор марганцовокислого калия.
Ход исследования
8–10 мл мочи смешивают с равным объемом соляной кислоты, приливают 1–2 мл хлороформа и 1–2 капли марганцовокислого калия. Пробирку закрывают и многократно опрокидывают, не взбалтывая. В присутствии индикана хлороформ окрашивается в голубой, синий или розовый цвет. При наличии в моче йодистых солей хлороформ также дает розовую окраску. В таком случае добавляют кристаллик гипосульфита. Исчезновение розовой окраски хлороформа говорит о присутствии йодистых солей. При наличии индикана розовая окраска не исчезает.
Необходимые реактивы
1. 0,2–0,4 г хлорного железа растворяют в 100 мл концентрированной соляной кислоты (реактив нестоек).
2. Хлороформ.
Ход исследования
10 мл мочи смешивают с равным объемом реактива, добавляют 1–2 мл хлороформа и опрокидывают пробирку несколько раз. Синее окрашивание хлороформа указывает на присутствие индикана в моче.