Принцип метода
Крезолфталеинкомплексон образует с кальцием в щелочной среде комплекс красно-фиолетового цвета, интенсивность окраски пропорциональна концентрации кальция. В реакционную смесь добавляют 8-оксихинолин, который связывает металлы, мешающие определению, но образует с кальцием менее прочный комплекс, чем крезолфталеинкомплексон.
Необходимые реактивы
1. Боратный буфер: 200 г борной кислоты (Н3ВО3, ортоборная кислота) растворяют при нагревании в 300 мл воды, добавляют 580 мл 5 н КОН, объем доводят водой в мерной колбе до 1 л, при температуре ниже 56 °С из раствора могут выпадать кристаллы.
2. Глицин 2 моль/л: 7,5 г глицина растворяют в 40 мл воды, переносят в мерную колбу и доводят объем до 50 мл, для консервации добавляют 2 капли хлороформа, хранят в холодильнике.
3. 8-оксихинолин (оксин), 1%-ный раствор: 500 мг препарата растворяют в 50 мл абсолютного спирта.
4. Рабочий буферный раствор: к 300 мл воды добавляют 12,5 мл боратного буфера и 5 мл раствора глицина, перемешивают и устанавливают величину рН в пределах 10,5–10,6 с помощью 5 н КОН, добавляют 50 мл 1%-ного раствора оксихинолина, переносят в мерную колбу вместимостью 500 мл и доводят до метки водой, после чего снова проверяют рН.
5. Крезилфталеинкомплексон, 0,1%-ный раствор: 10 мг крезолфталеинкомплексона растворяют в 100 мл основного буферного раствора (при хранении в холодильнике реактив стоек не более 2–3 дней); калибровочный раствор. Основной калибровочный раствор, содержащий кальций в концентрации 25 ммоль/л, готовят, растворяя 250 мг кальция карбоната (СаСО3) в 5 мл 1 н НСl. Раствор переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят водой до метки. Для консервации добавляют 2 капли хлороформа. Одновременно готовят раствор соли магния 3 мг/мл, растворяя 2,5 г хлорида магния (MgCl2 × 6Н2О) в 100 мл воды. Из этих растворов готовят рабочие калибровочные растворы согласно таблице 26.
Таблица 26
Определение кальция по цветной реакции с крезолфталеинкомплексоном
Ход исследования
К 3 мл рабочего раствора крезолфталеинкомплексона добавляют 0,05 мл исследуемой сыворотки, перемешивают.
Через 5 мин фотометрируют в кювете с длиной оптического пути 0,5 см при длине волны 500–560 нм (зеленый светофильтр) против рабочего раствора крезолфталеинкомплексона. Одновременно обязательно ставят хотя бы одну калибровочную пробу. Расчет ведут по калибровочной кривой либо по правилу пропорций.
Некоторые сорта стекла могут выщелачиваться, отдавая в раствор соли кальция, поэтому лабораторную посуду, особенно пробирки, желательно предварительно прокипятить в соляной кислоте. Определение желательно проводить в сыворотке или в плазме, полученной из гепаринизированной крови, так как щавелевая, лимонная кислоты и другие антикоагулянты, связывающие кальций, могут помешать определению.