Между долгой жизнью и хорошим обедом только та разница, что за обедом сладкое подают в конце[32].

Я уже рассказывала, как начала заниматься старением: услышала рассказ Синтии Кеньон о том, что мутации отдельных генов рецептора сигнального пути инсулина/ИФР-1 увеличивают продолжительность жизни и способствуют сохранению здоровья червей C. elegans. Выслушав ее выступление, я решила, что хочу делать – узнать, почему эти черви такие здоровые, и я понимала, как это сделать. Но прежде чем перейти к рассказу об этом, позвольте сказать еще несколько слов о том, как черви пролили свет на проблему старения и, в частности, как инсулиновый сигнальный путь регулирует продолжительность жизни.

Червь C. elegans служит модельной системой для изучения старения с начала 1970-х годов, и исследования были весьма плодотворными. Поначалу C. elegans использовали для изучения развития и нейробиологии, но уже в середине 1970-х впервые было упомянуто о его небольшой продолжительности жизни – около двух недель. За несколько лет было установлено несколько фактов, связанных со старением: питание влияет на продолжительность жизни червей, остановка в диапаузе увеличивает продолжительность жизни, а возраст родителей определяет характеристики потомства.

В 1983 году Майкл Класс описал нескольких долгоживущих мутантов C. elegans[1]. Эта работа удивительным образом предвосхищала наши теперешние знания об инсулиновом сигнальном пути (см. ниже), ограничении калорийности питания (глава 8) и хемочувствительных мутантах (глава 13). Никакие гены еще не были клонированы (до начала геномной эры было гораздо сложнее идентифицировать гены, особенно связанные с продолжительностью жизни), так что идентичность и функция соответствующих генов оставались неизвестны, но существование долгоживущих мутантов надежно подтверждалось. Дело, начатое Классом, продолжил Том Джонсон, который в 1988 году первым описал долгоживущего мутанта age-1, а в 1990-м выпустил в журнале Science статью о замедленном старении этого мутанта (в которой был единственным автором, что случается крайне редко)[2]. Сообщалось, что мутанты age-1 отличаются пониженным уровнем воспроизводства, что поддерживало идею о компромиссе между долгой жизнью и плодовитостью.

Примерно в то же время молодой профессор Калифорнийского университета в Сан-Франциско Синтия Кеньон, уже заявившая о себе благодаря исследованиям в области регуляции генов развития, начала интересоваться старением и предприняла скрининг долгоживущих мутантов. Ей нужно было научиться отделять родителей-долгожителей от потомства, и она применила генетический трюк. Кеньон выбрала такой исходный штамм, в котором потомство не развивается во взрослую форму, так что она следила только за родителями, выявляя долгоживущих мутантов. Этот полезный прием трудно применить на других животных, но у червей есть одна сверхспособность: в тяжелые времена они умеют нажимать на кнопку “пауза”. Иными словами, если в среде недостаточно еды, или червей слишком много, или очень высокая температура, C. elegans переходят в альтернативную личиночную фазу, называемую диапаузой, или dauer (что по-немецки означает “продолжительный”). В этом состоянии, напоминающем состояние споры, животное в предрепродуктивной фазе ожидает лучших времен (больше еды, снижение температуры), когда оно сможет перейти к нормальному развитию. Так черви переживают тяжелые времена в дикой природе.

Кеньон рассудила, что использование термочувствительных мутантов, которые переходят в диапаузу даже тогда, когда этого делать не следует, то есть при обилии пищи (“конститутивная диапауза”), может помочь визуально отличать стареющих родителей от их потомков. При нормальной температуре эти мутанты, переходящие в диапаузу (daf), растут как обычно, но если чашки с червями поместить в условия с повышенной температурой, потомство остается в спящем состоянии, в виде маленьких личинок, что облегчает идентификацию долгоживущих родителей просто по размеру. Но еще до начала скрининга Кеньон обнаружила, что штамм червей daf-2 (о котором вы уже кое-что знаете) отличается необычно большой продолжительностью жизни: черви daf-2 жили в два раза дольше своих родственников дикого типа! Кроме того, поскольку генетика диапаузы уже была хорошо изучена, было известно, что гены “дефектных по диапаузе” (daf-d) мутантов действуют на ген daf-2 эпистатическим образом, что означает, что потеря второго гена у мутанта daf-d “отключает” переход в диапаузу. Кеньон обнаружила, что другой ген мутанта daf-d, названный daf-16, необходим не только для перехода daf-2 в диапаузу, но и отвечает за его большую продолжительность жизни. Более того, мутанты daf-2 оказались довольно плодовитыми, что переворачивало основные представления о долгожительстве. (Эта статья в журнале Nature тоже отличается интересным составом авторов. Кеньон не смогла привлечь к изучению старения других сотрудников лаборатории, ей помогали только студенты, поэтому большую часть работы она проделала сама и является первым автором статьи, что в биологических науках очень необычно для ведущего исследователя.) Кеньон не только показала, что мутанты daf-2 живут долго, но и продемонстрировала эпистатическое взаимодействие генов регуляции продолжительности жизни на пути от daf-2 до daf-16.

Поначалу исследователи думали, что два гена долгожительства, daf-2 и age-1, действуют на разных сигнальных путях, поскольку соответствующие мутанты различаются по плодовитости и поскольку считалось, что второй мутант не переходит в диапаузу. Но позднее выяснилось: мутант age-1 имеет еще одну мутацию, влияющую на образование сперматозоидов, что, по-видимому, и является причиной его пониженной репродуктивной способности. Вскоре в лаборатории Кеньон было показано, что оба гена действуют на одном и том же “пути долгожительства”: это означает, что наличие у одного червя этих двух мутантных генов (двойной мутант daf-2; age-1) не позволяет ему жить дольше, чем живут черви с одной мутацией. Тем временем исследователи из лабораторий Гэри Равкана, Дона Риддла и Джима Томаса изучали эпистатическое взаимодействие генов диапаузы и установили, что гены daf-2 и daf-23 (еще один ген, ответственный за диапаузу) действуют на аналогичном участке пути, приводящего к диапаузе[3]. (Исходно считалось, что мутант age-1 живет дольше, но не переходит в диапаузу, из чего следовал вывод, что этот ген задействован в другом пути, однако в лаборатории Равкана было установлено, что ген age-1 уже был известен ранее под названием daf-23. Выяснилось, что мутант age-1 все-таки переходит в диапаузу, но при достаточно высокой температуре.)

Для продолжения работы было очень важно клонировать эти гены, чтобы понять суть пути долгожительства. И тебе, читатель, все же стоит вникнуть в скучные названия, предложенные первыми исследователями C. elegans в ответ на легкомысленные прозвища, принятые у исследователей дрозофил. Я прошу прощения, но это не моя вина. В 1997 году в лаборатории Равкана была разгадана загадка гена daf-2: этот ген кодирует рецептор, похожий на рецептор инсулина[4]. На мой взгляд, это открытие принципиальным образом изменило наше отношение к долгоживущим червям: их долгая жизнь – не просто странная особенность червей, но нечто, что может иметь реальное значение для человека. И это было замечательно не только потому, что мы смогли анализировать гены в контексте функционирования клеток (и перестать говорить о диапаузе), но и ввиду очевидных параллелей с физиологией млекопитающих. Когда вы слышите о рецепторе инсулина/ИФР-1, нельзя не понять, что это имеет какое-то отношение к человеку. Это важное замечание. Тот факт, что все эти гены связаны с диапаузой, представлял интерес для генетиков и для тех, кто работает с червями, но нелегко было убедить исследователей, работающих с другими животными, что эти пути долгожительства не являются специфической особенностью червей. Определение генетики червей и выявление соответствия с сигнальными путями млекопитающих стало реальным прорывом в исследованиях долгожительства. До этого момента предполагалось, что все аспекты долгожительства червей связаны с их умением переходить в диапаузу, тогда как у большинства животных нет такой способности. (Здесь следует заметить, что зимующие медведи и белки, как выяснилось теперь, имеют некоторые важные общие гены, регулируемые инсулиновыми сигналами.) Но труднее игнорировать наличие сигнального пути, зависящего от уровня питательных веществ, регулируемого инсулином и определяющего продолжительность жизни. Значение идентификации генов долгожительства у червей C. elegans сильно возросло ввиду очевидных параллелей с физиологией млекопитающих.

В конце 1990-х годов лаборатория Равкана поставила на поток клонирование генов диапаузы/долголетия, в том числе был клонирован ген рецептора инсулина/ИФР-1 (daf-2), фосфоинозитид-3-киназы (age-1/daf-23), субстрата рецептора инсулина/ИФР-1 (irs-1), фосфатазы PTEN (daf-18), киназы Akt (akt-1) и киназ пируватдегидрогеназы (pdk-1 и pdk-2)[5]. Лаборатории Равкана и Кеньон соревновались за скорейшее клонирование гена daf-16[6], который, как оказалось, кодирует транскрипционный фактор FOXO (forkhead box protein O) и о котором уже было известно из экспериментов с млекопитающими. Это дополнительно подтвердило значимость данного пути для человека[7], и мы уже обсуждали результаты анализа геномов, продемонстрировавших связь между FOXO и долгожительством (кроме того, уже было известно, что PTEN играет ключевую роль в развитии рака). Тот факт, что DAF-16 является транскрипционным фактором (регулирует экспрессию многих нижестоящих генов), чрезвычайно важен для нашего рассказа. Позднее Равкан идентифицировал почти 40 генов пептидных аналогов инсулина, используя хитроумный метод биоинформатики, что неожиданно выявило дополнительный уровень сложности этого, казалось бы, хорошо изученного пути[8]. В системе обнаружились новые элементы[9], но всплеск активности в изучении генов в конце 1990-х годов позволил раскрыть многие тайны сигнального пути, контролирующего продолжительность жизни.

По иронии судьбы двоякая роль генов инсулинового сигнального пути в переходе в диапаузу, которая по техническим причинам заметно ускорила их клонирование и идентификацию, возможно, косвенным путем замедлила принятие C. elegans в качестве универсальной модели для изучения старения. Я все еще иногда слышу высказывания исследователей, не работающих с червями, о том, что черви daf-2 не имеют никакого отношения к изучению продолжительности жизни у высших организмов, поскольку этот ген также регулирует переход в диапаузу. Многие упускают из виду данные из статьи Кеньон от 1993 года: черви daf-2 живут дольше, даже если температуру изменяют после той стадии, когда они принимают решение о переходе в диапаузу, или даже после личиночной стадии L3. То есть им не нужно проходить через диапаузу, чтобы жить дольше. И все же, подозреваю, кто-то может заявить, что это мутантные черви и поэтому они другие. Выдвигать этот аргумент стало труднее после того, как молодой сотрудник из лаборатории Кеньон Эндрю Диллин поместил диких (обычных) червей на чашку с бактериями, производящими двунитевую РНК гена daf-2 только у взрослых животных. Тем самым он отключил экспрессию гена daf-2 за счет РНК-интерференции уже после завершения стадии развития, однако и эти животные жили чрезвычайно долго[10]. С помощью РНК-интерференции daf-2 на все более и более поздних стадиях жизни червей Диллин и Кеньон смогли однозначно отделить регуляцию продолжительности жизни и от механизма диапаузы, и от воспроизводства (влияние РНКи на воспроизводство сказывалось при применении этой техники до третьей личиночной стадии, L3). Тем самым они одновременно убили двух надоедливых зайцев. Удаление белка DAF-2 на поздних этапах жизни, уже после завершения репродуктивной фазы, по-прежнему увеличивает продолжительность жизни[11]. Миф все еще живет, но ты, читатель, уже лучше понимаешь ситуацию!

Интересно, что методика первых экспериментов по определению продолжительности жизни червей не позволила исследователям идентифицировать еще один потенциальный путь, регулирующий диапаузу и продолжительность жизни. Сегодня мы отбраковываем (удаляем из расчетов) червей, умерших по неестественным причинам. Иногда черви залезают на край чашки, застревают и высыхают. Иногда они куда-то уползают, и мы просто не можем их найти! Худшее случается, когда они не могут правильно отложить яйца, что заканчивается “матереубийством”. Новорожденные черви разрывают или буквально взрывают мать, если вылупляются и начинают ползать еще внутри ее тела (да, это отвратительно, я знаю). Червей, погибавших из-за невозможности правильно отложить яйца, иногда в ранних экспериментах причисляли к умершим естественной смертью, так что оказывалось, что мутанты живут недолго или столько же, сколько обычные черви, и их больше не учитывали. Важный пример такого рода – черви с мутацией диапаузного пути с участием белка TGF-β. Кеньон и другие исследователи анализировали их продолжительность жизни и описали их как “переходящих в диапаузу, но без изменения продолжительности жизни”. В нашей лаборатории было показано, что эти мутанты на самом деле живут долго, если исключить вероятность разрыва тела в процессе воспроизводства. Мы установили это двумя способами. Во-первых, профиль экспрессии генов TGF-β мутантов во взрослом возрасте слишком сильно напоминает профиль мутантов daf-2, чтобы это было совпадением. Во-вторых, проводя контрольные эксперименты при исследовании репродуктивного старения (глава 11), мы обнаружили, что при остановке репродукции и, следовательно, при предотвращении гибели матери все черви с мутациями пути с участием TGF-β жили долго. Это достигается за счет регуляции двух генов инсулинового пути, ins-7 и ins-18, которые затем воздействуют на путь daf-2/daf-16. Таким образом, как инсулиновый сигнальный путь, так и диапаузный путь с участием TGF-β регулируют переход в диапаузу на ранних личиночных стадиях развития и продолжительность жизни в более позднем периоде, действуя в конечном итоге через инсулиновый путь.

Когда исследовательские группы Марка Тейтара и Линды Партридж в 2001 году сообщили о таком же явлении у мутантных дрозофил[12], стало еще более очевидно, что регуляция продолжительности жизни через инсулиновый сигнальный путь не является исключительной особенностью червей. Вообще говоря, изучение старения на модели дрозофил происходит гораздо дольше, поскольку дрозофилы стали модельной генетической системой почти за 100 лет до того, как Сидней Бреннер начал работать с C. elegans, так что исследования дрозофил продвинулись далеко вперед. Изучена зависимость продолжительности жизни дрозофил от температуры (1968 год) и сексуального статуса (1984 год). Линда Партридж и Мариана Волфнер первыми описали сокращение продолжительности жизни самок дрозофил из-за воздействия спермы и семенной жидкости (мы вернемся к этой теме в главе 12), а Марк Тейтар исследовал влияние теплового стресса в качестве гормезисного механизма[33] увеличения продолжительности жизни. В конце 1980-х годов Майкл Роуз провел знаменитый эксперимент, на протяжении многих поколений отбирая поздно размножающихся особей, что привело к появлению животных с увеличенной продолжительностью жизни, но генетические основы этих изменений оставались неизвестными и, как считалось, были связаны с несколькими генами[13]. Напротив, Партридж обнаружила, что мутанты chico имеют маленький размер из-за дефекта субстрата рецептора инсулина/ИФР-1 (IRS), действующего непосредственно после рецептора инсулина/ИФР-1, и при этом живут долго[14]. Аналогичным образом Тейтар установил, что дрозофилы с мутацией рецептора инсулина/ИФР-1 (InR) тоже являются долгожителями[15]. Эти данные показывают, что черви и дрозофилы имеют некую общность в регуляции продолжительности жизни и что сигнальный путь инсулина – эволюционно консервативный механизм регуляции продолжительности жизни. В 2004 году группа Тейтара показала, что белок dFOXO – гомолог DAF-16 и FOXO – регулирует продолжительность жизни дрозофил путем воздействия на головной мозг и жировую ткань[16]. Это согласовывалось с открытием, сделанным в лаборатории Кеньон в 2003 году: DAF-16 регулирует продолжительность жизни за счет действия на кишечник (регуляция метаболизма жиров) и нейроны[17]. Описание инсулиноподобных пептидов и других элементов инсулинового сигнального пути у дрозофил дополнительно подкрепляло эволюционные параллели между механизмами регуляции продолжительности жизни у червей и дрозофил[18].

Но можно ли распространить данные, полученные для беспозвоночных, на млекопитающих? На протяжении нескольких десятилетий ученые исследовали влияние гормонов роста на продолжительность жизни мышей, поскольку “карликовые” мутанты, появляющиеся в результате нарушения гипофизарной функции (у них отсутствуют факторы роста, включая инсулиноподобный фактор роста ИФР-1), являются долгожителями[19]. Было принято считать, что большая продолжительность жизни этих карликовых мышей связана с их маленьким размером, что не так уж глупо, поскольку многие маленькие животные, например маленькие собаки, живут дольше своих сородичей более крупного размера. Однако постепенно удалось разделить механизмы регуляции размера и продолжительности жизни, поскольку было установлено, что влияние единичных мутаций генов инсулинового сигнального пути на продолжительность жизни консервативно для всех млекопитающих. В 2003 году Гольценбергер с коллегами установили, что гетерозиготные по рецептору гена ИФР-1 мыши (с одной мутантной копией этого гена и одной копией гена дикого типа) живут долго и при этом, как дрозофилы, не обязательно имеют маленький размер[20]. Снижение активности инсулинового сигнального пути в жировой ткани мышей (отключение рецептора инсулина/ИФР-1 в жировой ткани) также увеличивало продолжительность жизни, как и в случае dFOXO в жировой ткани дрозофил и DAF-16 в кишечнике червей, что еще ярче демонстрирует аналогию с беспозвоночными животными[21]. Снижение уровня IRS2 (субстрата рецептора инсулина/ИФР-1) у мышей приводило к ослаблению аппетита и репродуктивной функции, сопрягая энергетический статус с плодовитостью[22]. Все эти результаты подтверждают, что у червей и млекопитающих реализуются одни и те же функциональные пути, и трудно поверить, что это явление характерно только для беспозвоночных животных. Еще более удивительно, что те гены, которые Юсинь Су впоследствии обнаружила у долгожителей в ходе полногеномного анализа ассоциаций (глава 3), тоже относятся к этому пути, в частности гены рецептора инсулина/ИФР-1 (InR), ИФР-1 и FOXO3a[23]. Но только совсем недавно этот путь стали рассматривать как возможную мишень для терапевтического действия: применение ингибитора фосфоинозидид-3-киназы (кодируемой геном age-1) на мышах среднего возраста позволяло увеличить продолжительность жизни животных на 10 % и улучшить некоторые показатели здорового отрезка жизни[24].

Так почему же все-таки черви с мутацией daf-2 так долго живут? Этот вопрос возвращает нас к моей личной истории. В 1999 году, когда я услышала доклад Синтии, стало ясно, что инсулиновый сигнальный путь через активность DAF-16 каким-то образом позволяет червям жить дольше. Поскольку было установлено, что daf-16 кодирует транскрипционный фактор FOXO, это подразумевало, что основной путь, увеличивающий продолжительность жизни мутантов daf-2, связан с какими-то транскрипционными изменениями, опосредованными белком DAF-16.

Я оказалась в правильном месте в правильное время. Биохимические исследования в Стэнфорде были одним из истоков разрастающегося направления геномики: Джо Деризи из лаборатории Пэта Брауна[34] придумал метод точечных микрочипов, Майкл Эйзен из лаборатории Дэвида Ботштейна – новые методы анализа и визуализации, а специалисты в области статистики, такие как Роб Тибширани, разработали новые подходы к анализу данных. Важно, что эти научные группы ускорили внедрение технологии микрочипов в исследования модельных организмов, поскольку открыто обменивались методиками, данными и инструментами – в отличие от коммерческих компаний по производству микрочипов, которые в первую очередь были нацелены на взаимодействие с исследователями, работающими с млекопитающими или в области медицины. Благодаря открытому доступу к этим инструментам исследователи, работающие с мелкими организмами, смогли создавать собственные микрочипы. Мой однокурсник Джо Деризи в то время был студентом в лаборатории Пэта Брауна. Джо и Пэт с конца 1990-х годов популяризировали подход “сделай сам”, читая курс лекций в лаборатории Колд-Спринг-Харбор. Всего за две недели студенты создали из отдельных деталей аппарат для микрочипирования, скопировали и размножили все 6 тысяч генов дрожжей в 96-луночном планшете, перенесли эти фрагменты ДНК на стеклянные пластинки и провели собственный эксперимент с микрочипами на дрожжах. Джо был настоящим проповедником: он убеждал всех, кто попадал в радиус его действия, включая меня, использовать в работе технологию микрочипов[35]. И хотя мои исследования никак не были связаны с анализом экспрессии, я уже многое знала об этом просто благодаря тому, что работала в одной комнате с Джо.

Почему снижение активности daf-2 не вызывает пагубных последствий, таких как диабет?

Возможно, тот факт, что потеря активности рецептора инсулина/ИФР-1 удлиняет жизнь и продлевает ее здоровый отрезок, противоречит интуиции, поскольку пониженная реакция на инсулин вызывает диабет. Действительно, люди с синдромом Ларона (см. главу 2) отличаются ослаблением сигнального пути ИФР-1 (и поэтому имеют карликовый фенотип), но реже болеют диабетом, как и долгожители с мутациями этого пути. Возможно, это легче понять, если сравнить мутантов daf-2 с периодически голодающими животными. У червей периодическое голодание вызывает активацию белка DAF-16[36], как и слабый инсулиновый сигнал, и усиливает реакцию на стресс, в результате чего животное становится здоровее. По-видимому, мутанты daf-2 интерпретируют низкую активность рецептора DAF-2 как сигнал легкого пищевого стресса и реагируют соответствующим образом, замедляя старение, что позволяет животному дольше размножаться. Избыток глюкозы быстрее убивает червей[37], что как раз напоминает ситуацию с диабетом у человека.

Возможно, вас заинтересует, почему же черви daf-2 не получают преимущество в популяции, если они такие здоровые и так долго живут. Дикий тип остается диким по одной простой причине: мутанты daf-2 “зафиксированы” в состоянии периодического голода и поэтому растут медленнее, позднее достигают половой зрелости, передают свои признаки с более растянутой периодичностью и в каждом поколении имеют меньшую численность потомства, чем животные дикого типа. Все это вместе не позволяет им добиться статуса победителя в эволюционной гонке: за несколько поколений черви дикого типа начинают преобладать над мутантами, поскольку вновь и вновь быстрее производят более многочисленное потомство. При жаре или недостатке пищи мутанты daf-2 выживают лучше, но в отсутствие стресса выигрывают животные дикого типа.

Позднее Джо получил престижную позицию в Калифорнийском университете в Сан-Франциско, и я решила, что буду работать там же в лаборатории Синтии, воспользовавшись рекомендациями Джо для создания моих собственных микрочипов для C. elegans, чтобы понять, почему черви daf-2 живут так долго[38]. Все невероятные способности daf-2 связаны с активностью транскрипционного фактора DAF-16/FOXO, который “включает” экспрессию генов в ответ на сигнал daf-2. Я знала, что, если мне удастся создать микрочип со всеми генами червя, я смогу сравнить долгоживущих червей с мутацией инсулинового сигнального пути и короткоживущих животных, а тогда мы поймем, что именно происходит в организме здоровых животных. Это был хороший путь для поиска ответа на важный вопрос и самое подходящее время, чтобы по нему пойти.

Следует сказать, что Синтия проявила щедрость, разрешив мне заняться этим проектом. Для его реализации было нужно много денег и определенная уверенность, что я смогу его завершить за разумное время, а гарантий не было никаких. Деньги требовались на покупку примерно 20 тысяч пар праймеров (коротких последовательностей ДНК)[39]. Для амплификации каждого из 20 тысяч генов C. elegans с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) нужна одна пара праймеров (реализация проекта стала возможна после секвенирования генома C. elegans). Затем эти последовательности ДНК упорядоченным образом наносят на стеклянные пластинки – по одной точке на каждый ген. Готовые пластинки используют для гибридизации: образцам ДНК с флуоресцентной меткой позволяют связаться с соответствующими точками на пластинке, а затем по интенсивности флуоресценции определяют уровень экспрессии гена в каждом образце.

На создание микрочипов ушло несколько месяцев, и Джо дал мне много советов. Единственная возможность использовать мои биохимические навыки представилась мне в первые недели работы, когда я выделила тонны (на самом деле 11 миллиграммов) полимеразы Taq, которая используется в ПЦР для создания копий фрагментов ДНК. Я проводила ПЦР целыми днями на протяжении нескольких недель, пока не размножила ДНК всех 20 тысяч генов[40]. Нанеся очищенные продукты ПЦР на пластинки, обработанные полилизином, я получила мой первый микрочип и начала эксперимент. Для обработки червей я использовала РНКи против daf-2, daf-16 и контрольные РНКи, отбирала образцы в разные моменты времени в середине жизни животных и могла видеть, какие транскрипционные изменения происходили с возрастом и какие из них действительно были связаны с инсулиновым сигнальным путем[41]. Я также отбирала образцы разных аллелей мутантов daf-2, мутантов age-1 и червей дикого типа, что позволяло стандартизовать анализ. Я взяла червей с большим избытком и заполнила инкубатор чашками десятидюймового диаметра: 15 чашек на каждую временную точку и 10 временных точек для эксперимента с каждым штаммом. (Поэтому, когда сотрудники из нашей лаборатории жалуются на “большой” эксперимент с несколькими маленькими чашками, я брюзжу, как нудная старуха, которая рассказывает, как она взбиралась в гору и спускалась с нее в снегопад.) Пометив мРНК мутантов daf-2 и daf-16; daf-2 на одном чипе двумя разными флуоресцентными красителями, я смогла найти гены, которые экспрессируются по-разному (то есть гены с повышенным и с пониженным уровнем экспрессии), и таким образом отличить стареющих червей от тех, которые оставались молодыми.

В любом случае это было оправданно. Собрав такое количество образцов в разные моменты времени для такого количества мутантов и проведя в общей сложности гибридизацию на 80 двухцветных микрочипах, я находилась в полной уверенности, что если ген экспрессировался в мутанте daf-2 или при РНКи и не экспрессировался при отключении гена daf-16, вполне вероятно, он и был мишенью на данном пути и регулировался и геном daf-2, и геном daf-16. С помощью компьютерной программы, написанной Майклом Эйзеном, мне с легкостью удалось обнаружить, что у долгоживущих червей светится довольно большая группа генов, которые образовывают кластеры в соответствии с характером экспрессии. Гены, которые я искала (“хорошие” гены, возможно помогающие червям daf-2 жить дольше), светились красным светом (высокий уровень экспрессии) в червях daf-2 и зеленым цветом (низкий уровень экспрессии) в червях daf-16.

Именно так я нашла гены, которые и рассчитывала найти, такие как ген супероксиддисмутазы sod-2, про который уже было известно, что он активно экспрессируется в мутантах daf-2, а также ген каталазы ctl-2, который работает совместно с sod-2. Ранее предполагалось, что эти два гена вместе с некоторыми другими действуют по цепочке ниже daf-2 и daf-16, так что я обнаружила их с облегчением – это был положительный контроль в моих экспериментах.

Однако такой же уровень экспрессии наблюдался еще у десятков других генов, и это означало, что sod-3 и ctl-2 были лишь частью ответа. К счастью, повышение уровня экспрессии большинства генов под действием daf-2 было вполне логичным[25]. К их числу относились гены белков теплового шока, которые способствуют укладке белков, особенно в стрессовых условиях; гены “протеостаза” (гомеостаза белков) и гены компонентов протеасомы, которые помечают и уничтожают поврежденные белки, оставляя только правильные и функциональные; ген металлотионеина, ответственного за устранение токсичности металлов (черви daf-2 – чемпионы в этом деле); гены антимикробных пептидов, которые вполне могут активироваться в мутантах, хорошо справляющихся с инфекцией; гены метаболизма жиров – и это соответствует наблюдению, что черви daf-2 запасают больше жиров; гены белков цикла лимонной кислоты (цикла Кребса), метаболизма трегалозы и глиоксилатного цикла, позволяющих смещать метаболизм в сторону синтеза углеводов при большом запасе жиров; гены цитохромов P450s, участвующих в трансформации токсичных соединений, а также в создании стероидных лигандов ядерных рецепторов гормонов; и гены компонентов механизма аутофагии (“самопоедания”), позволяющего клеткам осуществлять рецикл своих белков. Благодаря этому эксперименту список генов, активирующихся под действием гена daf-2, превратился в настоящий справочник элементов механизмов старения (в последующих главах мы поговорим о многих из них).

Напротив, некоторые гены отключались в мутантах daf-2 и активировались в мутантах daf-16. В первую очередь это были гены, задействованные в механизмах развития и метаболизма, причем некоторые способствовали сдвигу метаболизма жиров, который полезен развивающимся ооцитам, и это помогает объяснить, почему у червей daf-2 слегка пониженная плодовитость[26][42]. Многие гены не имели названий, а только номера, и мы поначалу называли их dod (downstream of DAF-16, ниже DAF-16), пока не установили их функцию и не дали им имена.

Я придумала, как сделать чипы и найти гены, но я не знала, как проверить влияние этих генов на продолжительность жизни мутантов daf-2, а ведь именно оно меня интересовало. Список генов говорит кое-что о биологических механизмах, но нужно проверить, какие из них играют действительно важную роль. Такая проверка помогла бы оценить справедливость различных гипотез. В рамках одной модели предполагалось, что регуляцию продолжительности жизни осуществляет лишь один ключевой ген, действующий после DAF-16, но возможна и иная ситуация. Традиционный путь генетических исследований слишком долог, поскольку предполагает скрещивание мутанта по каждому гену с мутантом daf-2 с последующим измерением продолжительности жизни двойных мутантов (конечно, такой подход возможен, но я не отношусь к числу очень терпеливых людей, и позиция постдокторанта ограничена по времени). Кроме того, этот подход пригоден только для работы с генами, для которых уже получены мутанты, однако в нашем случае многие гены были только предсказаны на основании последовательности в геноме, а мутантов еще не существовало (дело было задолго до изобретения технологии CRISPR[43]). В нашей лаборатории уже были получены хорошие результаты с применением метода РНКи, так что этот путь казался очевидным. Но меня не привлекала идея создания библиотеки РНКи для длинного списка генов, даже если бы я выбрала только 50 главных.

И тут мне по-настоящему повезло. Энди Фрейзер и другие сотрудники лаборатории Джули Аринджер в Кембридже использовали тот же самый набор праймеров для создания библиотеки РНКи для всех генов на хромосоме I, а потом и для остальной части генома, и Аринджер любезно предоставила эту библиотеку Синтии. Это позволило мне очень быстро перейти от составления списка генов к проверке их функции, просто поместив червей daf-2 на чашки с бактериями РНКи для каждого гена-кандидата и измерив их продолжительность жизни. Вскоре стало ясно, что для достижения максимальной продолжительности жизни мутантов daf-2 нужны многие из этих генов, но ни один ген в отдельности не давал значительного эффекта. Результат прямо противоречил доминирующей гипотезе, будто самый главный способ замедления старения – борьба с активными формами кислорода. На самом деле отсутствие супероксиддисмутазы sod-3 и ее партнера каталазы ctl-2 изменяли продолжительность жизни мутанта daf-2 лишь на 5–10 %, и то же самое относилось ко всем остальным генам.

Эти результаты оказались важными для понимания роли сигнального пути инсулина в регуляции продолжительности жизни в нескольких ключевых аспектах. Во-первых, они позволили исключить гипотезу, что DAF-16 регулирует активность лишь двух или трех генов, – вот почему поиски супрессора DAF-16 никогда бы не дали ожидаемого результата. Но, наверное, еще важнее, что наши данные окончательно развенчали представление о том, что мутантам daf-2 для долгой жизни требуется лишь справиться с окислительным стрессом, – а это была доминирующая концепция (теория АФК) в исследованиях старения. Многие гены активировались координированным образом, но каждый из них вносил лишь небольшой вклад в увеличение продолжительности жизни, что объясняет логику использования транскрипционного фактора как мишени на этом сигнальном пути: воздействуя на инсулиновый сигнал, который может изменяться в стрессовой ситуации, DAF-16 позволяет быстро включить сотни разных генов. И каждый такой ген, в свою очередь, вносит вклад в защиту клетки специфическим образом: сдвиг метаболизма углеводов и жиров помогает животному справиться с длительным голоданием, белки теплового шока стабилизируют белки, которые могут разворачиваться под действием избыточного нагрева, белки аутофагии помогают клетке утилизировать белки для сохранения энергии и рецикла, антимикробные белки защищают кишечник от нашествия патогенов, и все остальные позволяют противостоять самым разным стрессовым факторам (нагревание, металлы, гипоксия, ксенобиотики и др.). Каждый такой белок или фермент делает важное дело, и все они необходимы червям для долгой жизни. Замечательно, что большинство из этих белков синтезируются и в организме человека, и есть надежда, что мы поймем, каким образом их включать, чтобы позволить нашим клеткам тоже жить дольше.

Подобный координированный ответ и аддитивное влияние на продолжительность жизни было бы трудно или невозможно обнаружить без такого эффективного аналитического инструмента, как экспрессионный микрочип, а высокопроизводительный метод функциональной геномики с использованием РНКи сыграл решающую роль в изучении влияния этих белков на продолжительность жизни. Без этих двух инструментов идентификация и проверка каждого гена dod могла бы заканчиваться публикацией статьи, ошибочно утверждающей, что именно этот ген является важнейшим геном, действующим под влиянием DQF-1 (впрочем, это все равно происходит, даже если вклад таких генов составляет лишь 5–10 %).

Другой и, возможно, еще более эзотерический аспект нашей работы, на который редко обращают внимание, но который также чрезвычайно важен, – разграничение изменения экспрессии в результате старения и под влиянием инсулинового сигнала. Меня этот вопрос интересовал потому, что на протяжении всей истории исследований старения ученые объясняли свои результаты, прибегая к одному из двух взаимоисключающих предположений: либо ген меняется в процессе старения в результате старения, либо ген меняется в процессе старения в ответ на старение, то есть в компенсаторной реакции. До обнаружения долгоживущих мутантов было трудно отличить причину от следствия, и авторы, судя по всему, придерживались версии, которая им казалась более логичной на тот момент, полагаясь исключительно на известное им название гена. Например, если ген сильнее экспрессируется в организме старых животных, он либо нейтрален, либо оказывает пагубное действие. Но если выясняется, что ген кодирует белок теплового шока, вы сразу чудесным образом объясняете, что это “компенсаторная реакция для противостояния старению”. Это может быть так, а может быть и не так – в том-то и проблема: для понимания старения мы изучаем только изменения, происходящие при старении. Долгоживущие мутанты позволили избавиться от неопределенности и разграничить две эти модели.

Я хотела научиться с уверенностью различать регуляцию старения и долгожительства. Аспирант Стивен Маккэролл из лаборатории Кори Баргман заинтересовался моей работой и помог мне осуществить еще один анализ[44]. Упорядочивая данные по экспрессии по времени, мы попытались установить, являются ли черви daf-2 более молодыми в целом на уровне всего транскриптома, чем черви из контрольной группы или черви daf-16. Мы рассматривали весь транскриптом червя в каждый момент времени в качестве одного значения (вектора) и сравнивали его с другими значениями (с помощью так называемой корреляции Пирсона). Идеальное совпадение, такое как при сравнении образца с самим собой, дает максимальный коэффициент (+1), и эта точка окрашивается белым цветом. По мере изменения транскриптома коэффициент корреляции снижается (и точки окрашиваются в серый цвет, а затем в черный при полностью противоположном значении, – 1). Мы упорядочили эти точки по времени и рассчитали коэффициенты корреляции с остальными точками. Анализируя расположение идеальных совпадений, мы определяли, насколько быстро изменяются образцы. Интересно, что, несмотря на краткосрочные вариации, в долгосрочном плане все три типа животных (контроль, daf-2 РНКи и daf-2+daf-16 РНКи) имели в целом похожие транскриптомы. Это означает, что, даже если гены daf-2 и daf-16 отвечают за регуляцию многих генов (около 500), на уровне всего генома это сравнительно небольшая доля: daf-2 регулирует активность около 2,5 % генов в геноме червя, состоящего приблизительно из 20 тысяч генов. В целом инсулиновый сигнал почти не влияет на старение транскриптома, хотя скорость старения червей daf-2 снижается в два раза. Эту ситуацию можно объяснить так, что в червях daf-2 изменяется небольшая, но очень важная группа генов, что позволяет преодолевать глобальные изменения экспрессии в результате старения. Мне это кажется замечательным: экспрессия многих генов меняется с возрастом, но черви daf-2 в какой-то степени защищены от таких изменений. Значит, если мы найдем аналогичные гены у человека, мы сможем делать то же самое, и долгожители, возможно, уже это сделали. При наличии данных для долгоживущих мутантов мы способны отличить гены, которые вызывают такой эффект, от тех, которые не являются его причиной, и наконец разрешить проблему причинно-следственной связи, неизбежно возникающую при наблюдении исключительно за возрастными изменениями.

Еще один вопрос, на который мы ответим только при наличии транскрипционных данных, звучит так: “С каким именно участком ДНК связывается DAF-16?” Как все транскрипционные факторы, DAF-16 делает свою работу, распознавая специфическую последовательность ДНК в промоторной области гена, связываясь с ней и привлекая фермент РНК-полимеразу II, которая синтезирует матричную РНК на основании последовательности гена. В экспериментах in vitro показано, что транскрипционные факторы FOXO, гомологичные DAF-16, связываются с последовательностью TTGTTTAC, которую назвали “DAF-16-связывающим элементом”, или DBE[27]. Сильвия Ли и Гэри Равкан проанализировали геном C. elegans в поисках генов, имеющих такую последовательность в промоторах, и установили, что как минимум некоторые из кандидатов (17 генов) связаны с продолжительностью жизни и метаболизмом[28].

Я придерживалась противоположного способа рассуждений: если мы проанализируем промоторы всех генов dod, найдем ли мы последовательности, которые встречаются чаще, чем при случайном распределении? Этот объективный подход (так называемый анализ обогащения) позволяет определить наличие последовательности ДНК, которая встречается статистически чаще, чем при случайном распределении, но без необходимости задавать алгоритм поиска последовательности. И опять для выявления консенсусных последовательностей в обширных наборах данных я воспользовалась новыми методами генетического анализа (скрытой марковской моделью, СММ, и олигонуклеотидными чипами). И нашла кое-что интересное. Во-первых, в мотиве DBE встречаются вариации; хотя в центре всех последовательностей содержится элемент TTT (как во всех транскрипционных факторах FOXO), DAF-16 связывается с последовательностями, которые напоминают DBE, но не обязательно в точности такие же, и это объясняет, почему использование строгой последовательности TTGTTTAC не позволит выявить все истинные мишени DAF-16[45].

Интересно, что в ходе анализа был выявлен второй мотив, который стабильно присутствовал в генах с пониженным уровнем экспрессии. Этот “неканонический” участок связывания DAF-16 имеет сходство с так называемым “GATA мотивом” с последовательностью CTTATCA; позднее он был назван DAF-16-ассоциированным элементом, или DAE[29].

Судя по всему, сам DAF-16 не может связываться с этим мотивом, и предназначение мотива остается для меня загадкой. Мы не нашли никакой закономерности в его расположении относительно мотива DBE, но чаще всего (хотя и не всегда) он присутствует в промоторах генов, экспрессия которых снижается под действием DAF-16. И это также подтверждает, что мотив вряд ли связывается непосредственно с самим DAF-16, поскольку эти гены включены в мутантах, не имеющих фактора DAF-16. В любом случае наличие мотива DAE в промоторах генов dod показало, что на пути инсулинового сигнала действует еще один загадочный элемент. Меня очень интересовала суть этого фактора, поскольку его присутствие показывало, что мы не учитываем важную часть сигнального пути.

Годом позже я искала работу в университете и выступила с докладом на биологическом факультете Колумбийского университета, после чего ко мне подошли двое мужчин. По ошибке я решила, что старший из них – профессор. На самом деле младший был физик Хармен Бассмейкер, ставший биоинформатиком, а старший – его аспирант Рон Теппер. Рон – удивительный человек. Он заинтересовался биоинформатикой, прослушав несколько курсов после того, как продал свою компанию и вышел на пенсию, когда его дети уже окончили университет. Он мог проводить все свое время на собственной яхте на Багамских островах (и делал это время от времени), но начал новую жизнь в качестве аспиранта, а потом постдокторанта в лаборатории Хармена. Наверное, он был единственным “ученым джентльменом”, которого я когда-либо встречала. (Обычно я забывала о деловом прошлом Рона, поскольку мы беседовали только о науке, однако оно всплыло однажды, когда во время международного симпозиума по C. elegans все мы ночевали в общежитии Колумбийского университета, а он остановился в отеле Four Seasons.)

Рон хотел применить новые методы геномного анализа в исследованиях старения, так что они с Харменом разработали способ классификации всех DAF-16-зависимых генов срезу из нескольких исследований (моего и некоторых других исследований экспрессии в мутантах daf-2), хотя объединить данные разного типа, полученные с разными микрочипами, довольно сложно. Диссертация Рона была посвящена разработке алгоритма упорядочивания всех генов daf-2 по уровню экспрессии – от самой высокой до самой низкой. Его результаты подтвердили большинство моих предыдущих наблюдений, включая наличие DAE. Еще важнее, что, когда в рамках проекта modENCODE были опубликованы его результаты ChIP-seq[46] (связывание транскрипционных факторов с ДНК) для 22 транскрипционных факторов C. elegans, мы выиграли джекпот: стало ясно, что с загадочным мотивом DAE связывается малоизвестный транскрипционный фактор PQM-1 с мотивом цинкового пальца[30].

Потом мы проанализировали роль PQM-1 в проведении сигналов в мутанте daf-2. Анализ продолжительности жизни показал, что фактор играл важную роль, но настоящее озарение снизошло, когда Жасмин Ашраф из нашей лаборатории прислала мне по электронной почте результаты эксперимента, в котором она отключала инсулиновый сигнальный путь с помощью РНКи. Жасмин обнаружила, что регуляция PQM-1 происходит противоположным образом по отношению к регуляции DAF16: иными словами, при отключении daf-2 он перемещается не в ядро, а из ядра, а при отключении daf-18 (фосфатазы PTEN, которая в норме не позволяет DAF-16 входить в ядро) PQM-1 возвращается обратно в ядро. На самом деле отключение гена daf-16 заставляет PQM-1 перемещаться в ядро, а отключение гена pqm-1 заставляет DAF-16 двигаться к ядру. Я все еще помню, как смотрела на эти результаты. Мы с семьей ехали из Денвера в Аспен, и я читала письмо Жасмин, когда мы приближались к Континентальному водоразделу. Глядя на присланные ею фотографии, я наконец смогла понять, как работает PQM-1 и почему мы не видели этого на протяжении многих лет: фактически это была тень DAF-16, “анти-FOXO”. Когда DAF-16 находится в ядре и выполняет свою работу по противодействию стрессу, PQM-1 заблокирован и не активирует экспрессию генов развития (илл. 3)[47]. В целом это означает, что сигнал инсулина способствует либо росту и развитию червей, либо их устойчивости к стрессу, но не обеим функциям одновременно.

Илл. 3. Как DAF-16/FOXO и PQM-1 регулируют продолжительность жизни, сопротивляемость стрессу, рост и развитие. (A) При мутации или нарушении функции инсулинового рецептора DAF-2 происходит отключение сигнального пути, который удерживает DAF-16 вне ядра, и DAF-16 проникает в ядро, где благодаря своей активности в качестве транскрипционного фактора вызывает транскрипцию генов, помогающих поддерживать функцию клеток (генов, увеличивающих продолжительность жизни). (B) При включении инсулинового сигнального пути DAF-2 происходит фосфорилирование DAF-16 и его выталкивание из ядра; в ядро входит PQM-1, который способствует экспрессии генов роста и развития (генов, уменьшающих продолжительность жизни). Взаимоисключающие отношения между DAF-16 и PQM-1 позволяют клетке делать выбор между устойчивостью к стрессу или ростом и развитием (Tepper et al. 2013).

За время, прошедшее после первых открытий, мы стали лучше понимать, что происходит в сигнальном пути после воздействия DAF-16 (особенно процессы протеостаза и аутофагии), и были идентифицированы новые кофакторы DAF-16, которые регулируют его активность или взаимодействуют с ним. В их числе фактор HSF-1, активирующий экспрессию белков теплового шока и шаперонов; SKN-1/Nrf2, преимущественно реагирующий в ответ на токсический стресс; MXL/Mondo, который совместно с DAF-16 и HLH-30/TFEB инициирует процесс аутофагии; а также SWI/SNF, обнаруженный благодаря совместной иммунопреципитации с DAF-16[31]. Мы также стали лучше понимать сложность регуляции DAF-16, в которой задействованы не только киназы Akt, PDK-1 и PDK-2, но также SGK-1 (мы еще поговорим о ней в связи с TOR) и JNK-1, которая, судя по всему, в регуляции DAF-16 действует противоположным образом по отношению к другим киназам[32].

Как инсулиновый сигнальный путь регулирует продолжительность жизни?

Представьте себе хорошо питающееся животное, скажем, червя на гниющем яблоке в саду. Благодаря бактериям, плодящимся при гниении яблока, у червя много еды. При изобилии питательных веществ правильное “решение” для червя заключается в максимально быстром развитии и рождении максимального количества детенышей, пока обстановка этому благоприятствует. В таких условиях в ответ на пищевые сигналы из нейронов выделяется инсулин, который связывается с рецептором инсулина/ИФР-1 и попадает в циркуляцию, “включая” все рецепторы DAF-2. DAF-2 активирует киназу AGE-1 PI3, которая, в свою очередь, активирует киназы Akt и PDK, заставляя их фосфорилировать DAF-16/FOXO. В фосфорилированном состоянии два белка семейства 14-3-3 – PAR-5 и FTT-2 – связываются с DAF-16 и препятствуют его вхождению в ядро, когда в этом нет необходимости[33]. В результате PQM-1 может оставаться в ядре, активируя программу развития, позволяющую молодому червю превращаться во взрослую особь[34].

Теперь представьте себе того же червя или его неудачливого отпрыска, который находится здесь же, когда яблоко уже съедено и запас бактерий подходит к концу. Если червь избежал голодания на первой личиночной стадии (L1), он не перейдет в диапаузу, но будет голодать при взрослении. У него еще есть надежда: возможно, он доползет до нового яблока и нового источника бактерий. Если ему повезет, лучшей стратегией будет потратить некоторое время на себя, прежде чем начать размножаться. Если нейроны червя чувствуют, что пищи недостаточно, но голода еще нет, инсулиновый сигнальный путь “отключается”, что заставляет DAF-16 войти в ядро (а PQM-1 – выйти из ядра) и начать включать все защитные гены, которые помогут червю прожить дольше, пока он ищет пищу. Одновременно с этим клетки зародышевой линии получают сигнал затормозить воспроизводство в ожидании лучших времен (глава 8), что защищает ооциты до появления достаточного количества пищи для потомства. Если червь находит новый источник пищи, его нейроны высвобождают инсулин, который сообщает остальному телу, что пришло время остановить реакцию на стресс и возобновить репродукцию. Если же пищи нет, голодная личинка в стадии L1 перейдет в диапаузу – именно в этом состоянии пребывает большинство червей, когда их находят в дикой природе.

Конечно, черви не единственные животные, которым приходится испытывать голод, и, судя по всему, инсулиновый сигнал и компоненты FOXO, о которых я рассказывала, функционируют таким же образом в организме дрозофил и в клетках млекопитающих. Во всех этих системах недостаток пищи приводит к замедлению старения и улучшению реакции на стресс. Хотя исследователи, занимающиеся старением и продолжительностью жизни, воспринимают это как способ “замедления старения”, в эволюционном плане такая концепция не имеет смысла. Единственная причина, объясняющая существование ответа на пищевой статус, заключается в возможности помочь животному выиграть эволюционную гонку, то есть обеспечить максимальную вероятность распространения его генома. Это означает, что важно не как долго проживет данная особь, а сколько у нее будет потомков и смогут ли они выжить. И для этого животное должно сделать правильный выбор в плане репродукции. В хорошие времена нужно размножаться рано и быстро. (Одно интересное недавнее наблюдение: раннее потомство с большой вероятностью получается фенотипически гетерогенным, что позволяет ему выжить в разных условиях[35].) Но если потомству нечего будет есть, имеет смысл отложить репродукцию, поискать новые источники пищи и заняться размножением позже. Чтобы животное имело возможность размножаться, тело матери должно находиться в хорошей форме, тогда она произведет потомство и не умрет при родах. Так что все ухищрения для замедления старения нужны не для того, чтобы позволить голодной особи прожить до глубокой трех- или четырехнедельной старости, а чтобы обеспечить следующему поколению максимальный шанс на выживание.

В таком объяснении есть нечто унизительное: наше выживание до глубокой старости не так уж важно, и наше долгожительство на самом деле лишь побочный эффект сохранения хорошей физической формы для того, чтобы родить детей в среднем возрасте. Все остальное – просто дополнение. Обнаружение генов, регулируемых daf-2 и daf-16, и осознание консервативности этих сигналов у высших организмов помогло нам понять, как управлять некоторыми важнейшими “антивозрастными” процессами в клетке. И я счастлива, что мне удалось изучить транскриптом червя и больше узнать о регуляции продолжительности жизни.