Молекулярный гомеостаз в регуляции продолжительности жизни
Мусор – это что-то, от чего вы избавляетесь, – или болезнь. От меня вы не избавляетесь.
Мусорщики – невоспетые герои нашего общества. Несколько лет назад мы с семьей были в Вашингтоне во время приостановки работы правительства. Остановилось все, включая уборку мусора. Через несколько дней мешки с мусором и горы хлама начали вываливаться из контейнеров, загромоздили тротуары и высыпались на проезжую часть. Зловоние становилось все сильнее, а крысы смелели и карабкались по горам мусора прямо среди бела дня. В нормальной жизни мы не обращаем внимания на мусорщиков, но как только они перестают работать, мы очень быстро начинаем их ценить.
Клетки можно сравнить с городами: тысячи белков, выполняющих разную работу, столпотворение, трафик и, конечно же, отходы: поврежденные макромолекулы – изношенные элементы клеток. Когда количество клеточного мусора достигает опасного предела, нормальная работа прекращается. Для поддержания порядка клеткам нужна уборочная система, как мусорщики, которые вывозят отходы. Без этого важнейшего механизма, не позволяющего накапливаться сломанным элементам, нагромождение поврежденных макромолекул застопорит функционирование клетки. Для поддержания нормальной работы клеток необходим гомеостаз – способность поддерживать клеточный status quo, а механизмы гомеостаза – одна из тех вещей, которые непосредственно зависят от возраста.
Мы установили, что в некоторых ситуациях, таких как недостаток пищи, животным бывает нужно продлевать себе жизнь, но как происходит замедление старения на практике? Чтобы ответить на этот вопрос, сначала нужно понять, что такое старение на клеточном уровне: накапливающиеся с возрастом повреждения многих компонентов клетки (белков, ДНК, РНК, липидных мембран и органелл), часто в результате воздействия АФК (активных форм кислорода), которые вырабатываются органеллами, снабжающими клетку энергией, или в результате ослабления контроля качества при синтезе этих компонентов. Клетка справляется с такими повреждениями с помощью разных механизмов. Некоторые клетки просто умирают и замещаются новыми за счет стволовых клеток и регенерации (глава 10), но некоторые этого делать не могут. Не способные к регенерации клетки временно преодолевают повреждения за счет распознавания, устранения и замены поврежденных элементов. В сигнальных путях, регулирующих продолжительность жизни, таких как сигнальный путь инсулина или пищевые ограничения, некоторые клеточные механизмы “включаются” одновременно, что позволяет обнаружить и направить в рецикл слишком сильно поврежденные элементы и при этом замедлить синтез новых белков, чтобы ограничить возможность повреждений. Кроме того, в клетках эволюционировали элегантные механизмы для предотвращения аномального сворачивания вновь синтезированных белков, для выявления дефектов и мечения поврежденных белков с целью последующего расщепления и рецикла их аминокислот. В других процессах происходит распознавание, мечение и устранение поврежденных молекул РНК и митохондрий. Эти клеточные механизмы репарации играют важнейшую роль в замедлении старения.
Если вы вспомните центральную догму молекулярной биологии (ДНК → РНК → белок), вы также вспомните, что в ядре каждой клетки содержится ДНК, кодирующая все белки, которые может синтезировать эта клетка. ДНК нужна не только для того, чтобы производить копии самой себя с целью размножения, но и для производства продуктов генов – РНК и белков. Для поддержания функций клетки матричная РНК (мРНК) должна быть синтезирована без ошибок, а затем транслироваться в белки, которые выполняют ферментативные и другие функции, необходимые для функционирования клетки. На каждой стадии этого процесса возможны ошибки, которые приводят к накоплению дефектных продуктов (илл. 4). Но клетка, как Элизабет Уоррен[63], имеет план решения этой проблемы.
Илл. 4. Все элементы центральной догмы молекулярной биологии (ДНК, РНК и белок) подчиняются регуляции по зависимым от возраста механизмам, и каждый из них, в свою очередь, может влиять на продолжительность жизни.
Я буду двигаться в обратном направлении – от белка к РНК (и к ДНК в главе 10), поскольку не сомневаюсь, что вы уже слышали о наиболее известных случаях агрегации белков, способствующей возникновению нейродегенеративных заболеваний вроде болезни Альцгеймера. Гомеостаз белков, или протеостаз (модное слово в исследованиях старения), описывает поддержание целостности белков и процессов, предотвращающих накопление поврежденных белков и их токсичных агрегатов. Клетка может уменьшить количество поврежденных белков с помощью нескольких механизмов протеостаза: ослабить трансляцию, чтобы снизить количество синтезируемого белка, повысить качество фолдинга белков по мере их синтеза, контролировать транспорт белков через соответствующие органеллы, мечение и расщепление поврежденных и агрегированных белков, а также активировать рецикл компонентов для синтеза новых белков. По мере старения механизмы протеостаза нарушаются, что и приводит к накоплению поврежденных и агрегированных белков[1].
Здоровье клеток долгоживущих животных по сравнению с клетками их короткоживущих родственников в значительной степени объясняется качеством протеостаза. Пример C. elegans ярко демонстрирует важную роль поддержания целостности белков и механизмов репарации, поскольку соматические клетки этого червя во взрослом состоянии не заменяются новыми и животное не может рассчитывать на стволовые клетки и механизмы регенерации для замены поврежденных клеток в процессе старения. На протяжении всей взрослой жизни червя в его теле присутствуют одни и те же клетки, которые все это время должны нормально функционировать. И для этого нужен механизм гомеостаза белков. Когда мы идентифицировали гены, позволяющие клеткам мутантов daf-2 функционировать вдвое дольше, чем клеткам червей дикого типа[2], стало ясно, что они в значительной степени связаны с поддержанием функции белков, поскольку регулируют многие гены протеостаза. Мы обнаружили усиление экспрессии генов белков, участвующих в фолдинге других белков (их называют шаперонами), включая белки теплового шока, или в репарации и рефолдинге поврежденных белков, или в уничтожении белков в случае слишком серьезных повреждений (по механизму аутофагии). (Напротив, мы не заметили усиления экспрессии генов аппарата репарации ДНК, впрочем, возможно, потому, что в основном обращали внимание на соматические клетки – а не на клетки зародышевой линии, – которые больше не делятся и не передаются.) Путь DAF-16/FOXO оказывает наиболее сильное влияние на те аспекты протеостаза, которые важны для фолдинга, транспорта и рецикла белков. Позже мы обнаружили, что все долгоживущие мутанты характеризуются пониженной экспрессией генов, связанных с рибосомами и трансляцией белков, а значит, общим признаком для них является не только повышение экспрессии генов протеостаза, но и ослабление трансляции. У многих долгоживущих животных качество протеостаза выше, чем у короткоживущих видов, что оценивается по таким показателям, как расщепление и транспорт белков, ответ белков теплового шока и активность протеасом – эти показатели измеряли в клетках животных с разным коэффициентом долголетия (иными словами, функция протеостаза в клетках голого землекопа и карликовой сумчатой летяги налажена лучше, чем в клетках мыши и опоссума)[3].
В значительной степени функция протеостаза сводится к снижению количества поврежденных белков, от которых клетка должна избавляться, поскольку исправлять повреждения труднее, чем контролировать правильность синтеза белков с самого начала или ликвидировать аномальные белки. Дом проще содержать в чистоте, когда все уезжают на каникулы, и, возможно, самый эффективный способ предотвратить накопление поврежденных белков – прекратить синтезировать белки. Для долгоживущих особей характерна низкая активность рибосомных белков и ослабление экспрессии их генов. Даунрегуляция трансляции (снижение скорости превращения нуклеотидного кода мРНК в последовательность аминокислот, из которой формируется молекула белка) – это главный защитный механизм, задействованный во всех путях, ведущих к увеличению продолжительности жизни, но особенно при пищевых ограничениях, о чем мы говорили в предыдущей главе. Клетки могут понижать общий уровень синтеза белка за счет ингибирования трансляции или ослабления выработки белковых компонентов, необходимых для функционирования рибосом (трансляционного комплекса). Один из главных результатов полногеномного скрининга с применением РНКи, выполненного для C. elegans в начале 2000-х годов: выяснилось, что отключение элементов аппарата трансляции, таких как факторы инициации и элонгации или компоненты рибосомы, приводит к увеличению продолжительности жизни[4]. Ингибирование трансляции – очень эффективный способ снизить уровень повреждения белков, если клетка способна выжить при некотором ослаблении функций или более низкой скорости оборота (замены) белков. (Например, некоторые белки комплекса ядерной поры в мозге очень долго живут и практически никогда не заменяются новыми[5], что, возможно, и приводит к возрастным проблемам.) Как показывают генетические эксперименты, большинство из этих компонентов функционируют в условиях пищевых ограничений. Например, путь TOR является важнейшим регулятором ингибирования трансляции в условиях ПО.
Возможно, именно потому, что трансляция белка – ключевой фактор для продления жизни под влиянием ПО, размер ядрышка, где собираются рибосомы, обратно пропорциональным образом коррелирует с продолжительностью жизни: у молодых червей, дрозофил и мышей ядрышко маленькое, но увеличивается с возрастом, а у долгоживущих мутантов так и остается маленьким[6]. Результаты биопсии клеток людей среднего возраста после нескольких недель выполнения физических упражнений демонстрируют сокращение размера ядрышка, что вселяет надежду. Обратная корреляция между размером ядрышка и продолжительностью жизни указывает на сильную зависимость продолжительности жизни и здоровья от снижения уровня синтеза белка. Таким образом, размер ядрышка – хороший клеточный маркер старения, косвенным образом отражающий функцию рибосом и трансляцию.
После трансляции мРНК в последовательность аминокислот (пептидную цепь) начинается важный этап фолдинга белка, когда эти последовательности принимают правильную функциональную форму. В противном случае их липкие внутренние элементы (состоящие из гидрофобных аминокислотных остатков, обычно сконцентрированных внутри молекулы белка) оказываются экспонированными наружу. В результате они могут слипаться друг с другом, теряя функциональность, или, что еще хуже, притягивать другие клеточные элементы, образуя агрегаты аномально упакованных белков. Агрегаты вредны не только по той причине, что в клетке остается меньше функциональных белков, – они и сами токсичны для клетки. Предотвращение агрегации белков на этапе их формирования обеспечивают белки шапероны (от франц. chaperon – “сопровождающий”), которые обнаруживают липкие гидрофобные участки и помогают белкам принимать правильную форму и отправляться к соответствующему месту назначения или разъединяют агрегаты и заново придают белкам необходимую форму, если они сформировались неправильно. Поскольку исправление неправильной укладки требует больших энергетических затрат, некоторые шапероны, например белки теплового шока (heat shock proteins, HSP), для исправления аномально собранных белков расходуют энергию от гидролиза АТФ[7]. Фактор теплового шока HSF-1 сам не является шапероном, скорее это транскрипционный фактор, регулирующий экспрессию генов HSP и других генов, помогающих клетке переживать стрессовые условия за счет строго регулируемого процесса активации. HSF-1 действует на инсулиновом сигнальном пути совместно с транскрипционным фактором DAF-16/FOXO и критически важен для увеличения продолжительности жизни мутантов daf-2, поскольку эти два транскрипционных фактора регулируют экспрессию многих шаперонов[8].
Агрегация – один из самых известных типов дисфункции белков, и большинство из нас слышали о ней в связи с неврологическими заболеваниями, такими как болезнь Альцгеймера (БА), болезнь Паркинсона (БП) и боковой амиотрофический склероз (БАС), а также в связи с несколькими ужасными инфекционными прионными заболеваниями, такими как коровье бешенство и болезнь Крейтцфельдта – Якоба (БКЯ). Белковые агрегаты хорошо изучены в связи с данными патологиями, но нет никакого сомнения, что по мере старения клеток и нарушения их функций в них случайным образом накапливаются белки и с другими типами повреждений.
Болезнь Альцгеймера характеризуется двумя главными признаками – появлением агрегатов бета-амилоидных пептидов (также называемых старческими бляшками) и нейрофибриллярных клубков, образованных тау-белком, который ассоциирован с микротрубочками. Другие белковые агрегаты, такие как SOD1 и альфа-синуклеин, связаны соответственно с нейродегенеративным заболеванием БАС и болезнью Паркинсона, а более мелкие олигомеры могут оказывать токсическое действие, вызывая синаптическую дисфункцию в результате воспаления и нарушения регуляции транспорта ионов через мембрану. Болезнь Хантингтона – редкая патология, вызванная экспансией трехнуклеотидных повторов в гене белка хантингтина, из-за чего белок становится длиннее, расщепляется на фрагменты и образует агрегаты через свои полиглутаминовые повторы.
При болезни Альцгеймера происходит накопление агрегатов бета-амилоида (Aβ) и тау-белка соответственно снаружи и внутри клетки, и поэтому на протяжении последних тридцати лет исследователи активно ищут способы ослабления агрегации бета-амилоида. Однако количество старческих бляшек не очень хорошо коррелирует со степенью когнитивных нарушений, и люди без деменции иногда имеют такие же нейропатологические признаки[9], так что, возможно, бляшки бета-амилоида не являются истинной причиной БА. Интересно, что некоторые крупные агрегаты Aβ могут оказывать защитное действие, по-видимому служа резервуаром для скопления более токсичных растворимых олигомеров Aβ, которые и вызывают заболевание. Вероятно, именно поэтому не приносят пользы лекарства, разработанные для устранения бляшек крупных агрегатов амилоида[10], а в некоторых случаях они даже усугубляют тяжесть заболевания[11]. Возможно, другие лекарства, направленные на борьбу с токсичными олигомерами и другими белками (например, тау вместо Aβ), помогут предотвратить их распространение при БА и БП.
Белки прионного типа тоже агрегируют, но еще хуже, что они действуют подобно инфицирующим агентам: один белок в специфическом состоянии (аномально упакованный прион – белок в инфекционной форме) способен заставить другие белки перейти в такое же состояние, действуя в качестве “затравки” для агрегации, которая может распространяться даже на другие клетки. Прионные белки вызывают такие заболевания, как хроническая изнуряющая болезнь, болезнь Крейтцфельдта – Якоба, фатальная семейная бессонница, скрепи, куру и бычья губчатая энцефалопатия (ее чаще называют коровьим бешенством), которая у человека может перерасти в БКЯ. В конце 1980-х годов в Великобритании употребление мяса и костной муки от зараженных животных привело к вспышке губчатой энцефалопатии, ставшей причиной гибели 177 человек и уничтожения примерно 4 миллионов коров. Агрегаты прионов чрезвычайно стабильны и не распадаются при приготовлении пищи. Считается, что именно по этой причине в некоторых случаях БКЯ вызывает куру, поскольку каннибалы из племени форе в Папуа – Новой Гвинее готовят и едят человеческий мозг в ходе погребального обряда. На сегодняшний день БКЯ чаще всего возникает в результате несчастных случаев в лабораториях, где работают с тканями, инфицированными прионами, поскольку сложно избавиться от прионов с помощью дезинфекции. Ужасно, что во Франции за последние десять лет было более десяти случаев заражения прионами в лабораториях, в том числе через порез и заражение вариантом приона, приведшим к развитию заболевания через семь лет после несчастного случая. С тех пор исследования прионов во Франции приостановлены[12].
Вас может заинтересовать, зачем клеткам нужны белки, способные принимать форму, аналогичную форме прионов: какой в этом смысл? Эксперименты с моллюсками Aplysia и дрозофилами[13] показали, что прионы играют роль в формировании долгосрочной памяти (и в этом есть определенная логика, поскольку прионы сами по себе представляют некую молекулярную форму памяти), и, возможно, другие животные тоже используют их в механизмах памяти. Кроме того, прионы задействованы в механизмах врожденного иммунитета и программируемой клеточной смерти и в функционировании стволовых клеток[14]. Мы не знаем, регулируется ли образование прионов в этих обычных процессах, но если такая регуляция существует, с ее помощью мы могли бы научиться обращать процесс образования прионов и “разворачивать” эти аномальные белковые агрегаты. Мы не знаем, усиливается ли агрегация прионов с возрастом, и было бы интересно это установить.
Возможно, вы любите карамельную корочку на крем-брюле, и реакция Майара[64] позволяет поджарить вкусный стейк, но химические реакции с участием сахаров вредны для белков внутри наших клеток, поскольку побочные продукты метаболизма (гликолиза) могут повреждать белки, взаимодействуя с аминокислотами. Повреждения за счет модификации сахаров могут усиливаться с возрастом и при метаболических нарушениях. Реакционноспособные α-дикарбонильные производные сахаров постепенно накапливаются и взаимодействуют с белками, образуя конечные продукты гликирования (advanced glycation end products, AGE), которые мешают функционированию клеток[15]. Обилие сахаров в рационе питания, хроническая гипергликемия, как при диабете, а также регулярное приготовление пищи с помощью сухого тепла способствуют накоплению побочных продуктов катаболизма глюкозы, что, в свою очередь, может приводить к развитию диабетической нейропатии. В частности, AGE появляются на терминальных стадиях почечной недостаточности и вносят вклад в прогрессирование возрастных нейродегенеративных нарушений. Долгоживущие белки в наибольшей степени подвержены влиянию AGE, поскольку редко обновляются. При умеренно высоком содержании глюкозы в пище черви живут недолго[16], а потеря фермента глиоксалазы GLOD-4, который в норме разрушает AGE, в условиях избытка глюкозы дополнительно укорачивает жизнь[17]. Использование модельных беспозвоночных животных позволяет проводить скрининг химических веществ, понижающих уровень AGE, для идентификации терапевтических мишеней[18]. Кроме того, AGE поддерживают воспаление, поскольку рецептор AGE (RAGE) активирует воспалительные сигнальные пути с участием транскрипционных факторов иммунного ответа NF-κB, усиливая эффект старения при метаболических и нейродегенеративных расстройствах[19].
Клетки умеют удалять из белков аномальные сахарные группы, а также сортируют поврежденные белки, предотвращая накопление покрытых сахарами белков в дочерних клетках, чтобы сохранить их в первозданном состоянии. Поврежденные окислением карбонилированные белки с возрастом накапливаются в старых материнских клетках дрожжей, но преимущественно в них же и остаются при отделении дочерних клеток. В дрожжах это асимметричное наследование регулируется белком SIR-2[20]. Но у C. elegans удаление карбонилированных белков в процессе обновления ооцитов не связано с действием SIR-2; вместо этого для обновления белков клетки зародышевой линии прибегают к помощи протеасом (см. ниже)[21]. Понимание механизмов сортировки и обновления белков для омоложения клеток позволит разработать мощный подход для более длительного поддержания наших клеток в функциональном состоянии.
Разбирая кладовку, вы, возможно, используете наклейки с надписями “починить”, “отдать” или “выбросить”. С этой же целью белки связываются с небольшой молекулой убиквитина при помощи фермента убиквитинлигазы. В ходе реакции к белкам присоединяются цепочки убиквитина, и эти убиквитиновые метки распознаются другими белками, которые транспортируют предназначенные для расщепления белки в конечный пункт дислокации – в протеасому, белковый комплекс в форме бочонка. В протеасоме поврежденные белки разбираются на части (на аминокислоты), которые затем используются заново. Убиквитин-протеасомная система (УПС) – главный механизм рецикла белков, который необходим для долгой жизни, но ослабевает в старости, что может играть роль в накоплении белковых агрегатов при многих возрастных заболеваниях. Долгоживущие мутанты daf-2 регулируют этот путь за счет усиления экспрессии соответствующих белков, а у млекопитающих в регуляции УПС участвует фактор FOXO[22].
Ранее мы уже упоминали, что в митохондриях происходит активация ответа на несвернутые белки (UPR), помогая поддерживать гомеостаз клетки[23]. В процессе UPRmt задействован сигнальный путь ATFS-1[24] – хитроумный механизм, запускающий реакцию на стресс в тот момент, когда в результате нарушения функции митохондрий перестает действовать сигнал “все хорошо”. Для реализации механизма нужны как митохондриальные, так и ядерные элементы, включая ацетилтрансферазу CBP/p300, деметилазы гистонов с доменами Джуманджи и метилтрансферазы гистонов MET-2/SETDB1, что говорит о важной роли регуляции хроматина ядра для процессов репарации в митохондриях. Это логично, если учесть, что митохондрии производят лишь несколько собственных транскриптов и белков и нуждаются в генах, хранящихся в ядре[25]. Поскольку митохондрии выполняют в клетках очень важную функцию, которая нарушается с возрастом, клеточный ответ на дисфункцию митохондриальных белков чрезвычайно важен для здоровья, и идентификация путей усиления этого ответа может способствовать продлению жизни[26]. Нейроны особенно чувствительны к митохондриальному стрессу и для ответа на митохондриальный стресс, судя по всему, посылают сигналы не только в ядро, но и соседним клеткам и даже, возможно, клеткам разных поколений[27].
Несформированные и неправильно сформированные белки накапливаются также и в эндоплазматическом ретикулуме (ЭР), поскольку именно в этой органелле происходит мечение белков для секреции или сортировки после трансляции. При нарушении фолдинга белка после трансляции такой белок может расщепляться в ЭР[28]. Подобно механизму UPRmt, механизм UPRer (Хоакин Навахас Аседо из компании MadScientist называет его “паникой в ЭР”) опосредован сигналами между органеллой и ядром, контролирующими активность соответствующих компонентов и важными для сопротивления клеточному стрессу и повреждениям.
Если бы механизмы протеостаза работали постоянно, клетки и организмы никогда бы не старели, но, к сожалению, с возрастом все механизмы ослабевают. Долгоживущие мутанты производят больше компонентов протеостаза, чем обычные особи дикого типа, что отчасти объясняет, почему мутанты daf-2 остаются здоровыми в два раза дольше. Аналогичным образом при ограничении питания животные ослабляют синтез белков, что снижает количество поврежденных белков, а также активируют механизм аутофагии, уничтожающий дефектные элементы и позволяющий заново использовать их составляющие. Некоторые наиболее долгоживущие виды и виды с очень высоким коэффициентом долголетия имеют более эффективный протеостаз, чем филогенетически родственные короткоживущие виды. Таким образом, механизмы протеостаза очень важны для здоровья клеток и долгой жизни.
Конечно, при делении постаревших клеток тоже образуются новые клетки, и во взрослых организмах белки повреждаются, но каким-то образом клеткам удается производить совершенно здоровое потомство. Как клетки “бессмертной” зародышевой линии, в частности ооциты сравнительно старых матерей, противостоят повреждениям белков? Как я уже рассказывала, Гудо и Агиланью показали, что поврежденные белки накапливаются в неоплодотворенных ооцитах C. elegans только до тех пор, пока не попадают в место оплодотворения, а здесь – хоп! – все поврежденные белки исчезают. Этот волшебный процесс очистки белков происходит под влиянием сперматозоидов за счет активации в ооцитах фермента V-АТФазы[30]. Этот элегантный механизм позволяет омолаживать ооциты только в случае необходимости, то есть только тогда, когда возникает возможность оплодотворения при появлении сперматозоидов.
Способность перенимать такой же механизм, как программа омоложения белков в ооцитах, позволила бы и старым соматическим клеткам омолаживать самих себя, что на уровне всего организма животного приводило бы к увеличению продолжительности жизни. В ранних исследованиях протеостаза ученые уделяли основное внимание автономным клеточным механизмам, но теперь интерес все больше переключается на системную регуляцию протеостаза[65]. На самом деле в некоторых механизмах сенсорной регуляции продолжительности жизни (глава 13) происходит аутсорсинг: соответствующие нейроны не просто обновляются, они воспринимают внешние сигналы (такие как недостаток калорий, газовый состав среды или температура), а затем пересылают эти сигналы другим тканям, где индуцируется и координируется процесс протеостаза (например, активация ответа на несвернутые белки) в организме животного в целом[31]. Это означает, что клетка не обязательно должна быть повреждена, чтобы получить преимущества от механизмов омоложения, но пользуется услугами индикаторных клеток (“канареек в угольной шахте”), чтобы предвосхитить необходимость репарации.
Белки, помеченные ярлыком “в рецикл”, включаются в регулируемый процесс, называемый аутофагией. Непоправимо поврежденные белки и другие клеточные компоненты отделяются от остального содержимого клетки, чтобы они не нанесли дополнительного вреда. В процессе аутофагии клетка расщепляет эти поврежденные белки и компоненты на составляющие аминокислоты, которые используются заново. Аутофагия играет ключевую роль в регуляции продолжительности жизни[32]. Замедление или нарушение процесса аутофагии – признак старости и некоторых возрастных заболеваний, включая рак[33], так что изучение механизмов аутофагии и идентификация ее фармакологических активаторов поможет с ними бороться.
Механизм реализуется в нескольких вариантах: микро- и макроаутофагия, а также аутофагия, опосредованная шаперонами. Кроме того, некоторые органеллы имеют свои специализированные механизмы расщепления (например, митофагия, лизофагия, аутофагия в ЭР). В случае макроаутофагии вокруг поврежденных белков формируются вакуоли, которые направляются в лизосому – специализированную органеллу, отвечающую за процесс расщепления. Особенность лизосомы в том, что внутри этой окруженной мембраной везикулы совсем другое значение pH, и это позволяет ферментам расщеплять белки в условиях кислой среды. Расщепление происходит внутри замкнутой везикулы, так что остальные части клетки защищены от этих потенциально опасных реакций. Кроме того, лизосомы способны самостоятельно затягивать в себя белки по механизму микроаутофагии. Аутофагия при участии шаперонов – более селективный процесс, когда специальный рецептор на мембране лизосомы, называемый LAMP2A, принимает комплексы белков с шаперонами для переноса в лизосому. Для правильного функционирования лизосом, ответственных за аутофагию, нужны АТФазы, позволяющие осуществлять перенос протонов (H+) для создания кислых значений pH. Когда от материнской дрожжевой клетки отпочковываются новые незрелые дочерние клетки, разница значений pH в цитозоле (среда в дочерних клетках более кислая), возникающая благодаря несимметричному распределению протонных АТФаз плазматической мембраны, позволяет сохранять “молодость” белков дочерних клеток.
За счет аутофагии происходит рецикл разных макромолекул, а не только белков. Неудивительно, что в условиях пищевых ограничений аутофагия усиливается: рецикл аминокислот, жиров, метаболитов и углеводов – великолепный способ очистки клетки и одновременно получения полезных веществ при голодании. Вообще говоря, любой важный путь, ведущий к увеличению продолжительности жизни, в том числе пищевые ограничения (через сигнальные пути TOR и AMPK и ядерную локализацию TFEB) и сигнальный путь инсулина/ИФР-1 (через транскрипцию FOXO), включает в себя механизм аутофагии.
Вероятно, для предотвращения ошибочного непреднамеренного расщепления внутриклеточных белков и органелл процесс аутофагии происходит в пространстве, ограниченном специализированными мембранами, и строго регулируется. В аутофагии принимает участие очень большое количество белков, включая беклин, белки семейства ATG и рецептор p62/SQSTM-1 (в человеческих клетках это секвестосом-1). Многие из них впервые были идентифицированы в таких маленьких модельных организмах, как дрожжи, черви и дрозофилы, однако они высоко консервативны и присутствуют в клетках млекопитающих. Важную роль в аутофагии играет фосфатидилинозитол-3-фосфат, участвующий в формировании нагруженных везикул, сливающихся с лизосомами для последующего расщепления компонентов[34]. Как вы могли понять, наличие многочисленных механизмов аутофагии говорит о том, какую важную роль играет этот процесс в поддержании здоровья клеток. На каждом пути, ведущем к лизосоме, задействовано много разных белковых компонентов, и все пути регулируются разными способами. Некоторые лекарства усиливают аутофагию (например, метформин, рапамицин, уролитин А)[35] и улучшают здоровье модельных организмов, но нужны и негативные регуляторы аутофагии, позволяющие предотвратить возможный разрушительный эффект, так что гомеостаз аутофагии – важный параметр здоровья клетки.
На протяжении многих лет в центре исследований старения были вопросы протеостаза и репарации ДНК, но недавно вновь возник интерес к среднему звену центральной догмы – к РНК. Задним числом кажется чрезвычайно странным, что в исследованиях старения так мало внимания уделяли контролю качества РНК при таком интересе ко всем другим аспектам поддержания клеточных и молекулярных механизмов. Что происходит при повреждении РНК, необходимой для синтеза белков? Обязательно должна существовать система, ответственная за поддержание качества РНК, и она наверняка играет важную роль в регуляции продолжительности жизни. Вообще говоря, функция РНК строго регулируется в таких процессах, как сплайсинг, редактирование, нонсенс-опосредованный распад, и других посттрансляционных реакциях, поэтому вполне логично предположить, что клетка имеет механизмы “наблюдения за РНК”, которые отслеживают возрастные изменения[36]. Уже известно, что синтез мРНК (транскрипция) с возрастом подвергается более значительным вариациям и хуже контролируется, а долгоживущие мутанты лучше сохраняют контроль над этим процессом[37]. Вообще говоря, усиление гетерогенности транскриптов служит маркером старения (однако слишком неопределенным, чтобы его можно было использовать в анализах крови). Но еще сравнительно недавно мы не знали, как именно старение влияет на контроль качества РНК.
Для репарации различных повреждений РНК требуются разные механизмы. Иногда молекулы мРНК случайным образом обрываются при синтезе, что приводит к появлению аномальных транскриптов, а это опасно для клетки, особенно если они транслируются в нефункциональные, неполные или неправильно сформированные белки. Нонсенс-опосредованный распад (НОР) предназначен для специфического удаления этих транскриптов, на которых часто имеются преждевременные стоп-кодоны или другие маркеры, указывающие на их нефункциональность. В лаборатории Ли Сынджэ (Корейский передовой институт науки и технологии) ранее было показано, что РНК-геликаза C. elegans, называемая HEL-1, регулирует продолжительность жизни через путь IIS/FOXO, и благодаря скринингу РНКи был выделен один элемент механизма НОР[38]. С помощью репортерной системы с зеленым флуоресцентным белком для определения стоп-кодонов исследователи обнаружили появление аномальных транскриптов и установили, что количество таких ошибок увеличивается с возрастом, что не удивительно. Кроме того, они выяснили, что долгоживущие мутанты daf-2 лучше умеют предотвращать появление аномальных транскриптов за счет усиления экспрессии белков, участвующих в НОР[39]. Механизм НОР необходим для достижения максимального эффекта долголетия не только мутантов daf-2, но и в других путях, в том числе у мутантов с измененной функцией митохондрий (isp-1) и изменением пищевого поведения (eat-2), из чего следует вывод, что контроль качества РНК, опосредованный НОР, является необходимым и общим для многих механизмов долголетия. Таким образом, поддержание качества РНК – недооцененный аспект клеточного гомеостаза.
Контроль качества РНК осуществляется также за счет правильного сплайсинга. Гены большинства эукариот экспрессируются во многих вариантах, поскольку молекулы мРНК окончательно формируются путем склеивания фрагментов, считанных с отдельных частей генов, называемых экзонами, и вырезания расположенных между ними интронов: этот процесс “смешивания и подгонки” обеспечивает вариабельность продуктов в группе генов одного типа. Процесс вырезания интронов и соединения конкретных экзонов называется сплайсингом РНК и очень строго регулируется. Вы можете себе представить, насколько полезна для сложных организмов возможность производить слегка (или очень сильно) различающиеся версии одного и того же гена для реализации разных функций, в разных местах или в разные возрастные периоды. Но, как и в любом сложном механизме, тут могут возникать ошибки. Используя флуоресцентную репортерную систему, предложенную Масатоси Хагиварой, Хейнц с коллегами наблюдали за сплайсингом в клетках C. elegans и обнаружили, что с возрастом количество ошибок при сплайсинге увеличивается, но в условиях пищевых ограничений эта тенденция подавляется[40]. Для этой активности необходим фактор SFA-1, который регулируется через путь AMPK/TORC1. Аналогичным образом в лаборатории Адама Антеби (Институт биологии старения Макса Планка) был проведен генетический скрининг в поисках нового холодоустойчивого мутанта C. elegans и был обнаружен фактор сплайсинга RNP-6 (поли(U) – связывающий фактор 60, PUF60, у млекопитающих). Этот фактор действует раньше фактора SFA-1 и задействован в механизмах иммунитета как у червей, так и у млекопитающих[41]. Роль сплайсинга РНК в увеличении продолжительности жизни в условиях ПО была дополнительно подтверждена при изучении транскрипции в клетках печени макак-резусов, которых ограничивали в потреблении калорий. Исследователи из группы Розалин Андерсон (Университет Висконсина) провели расширенный анализ с оценкой показателей транскрипции, синтеза белков, метаболитов, жиров и посттрансляционных модификаций у приматов в условиях пищевых ограничений, и анализ выявил не только ожидаемые изменения в рибосомах и метаболических процессах, но и значительные изменения “сплайсосомы” (аппарата сплайсинга)[42]. Исследователи оценили результаты сплайсинга, которые опять-таки отражали изменения в метаболизме. Таким образом, режим ПО не только поддерживает качество метаболизма в целом, но и влияет на состав продуктов сплайсинга РНК, способствуя необходимым перестройкам метаболизма.
С возрастом изменяются и другие функции РНК. МикроРНК – маленькие молекулы РНК в основном с регуляторной функцией – с возрастом изменяют характер экспрессии; они являются биомаркерами старения и очень важны для регуляции продолжительности жизни[43]. Некоторые микроРНК играют важную роль в процессах неавтономной регуляции старения. Например, микроРНК miR-71 C. elegans при старении изменяет характер экспрессии[44], способствует ослаблению производства клеток зародышевой линии и связывает восприятие запаха пищи с продолжительностью жизни через регуляцию протеостаза в кишечнике[45].
Еще один процесс редактирования РНК, в каком-то смысле более эзотерический, тоже связан с продолжительностью жизни – как у людей, так и у червей. Аденозиндеаминазы РНК (ADAR) осуществляют модификацию, заключающуюся в превращении аденозина в инозин (замена A на I), в результате чего микроРНК иначе распознают свои РНК-мишени[46]. Замена A на I изменяет характер РНК-интерференции и тем самым модулирует ингибирование трансляции под действием микроРНК. Такой процесс редактирования помогает системе врожденного иммунитета отличать свою РНК от РНК чужеродных патогенных организмов[47]. Паола Себастиани с коллегами обнаружили, что восемнадцать однонуклеотидных повторов (SNP) в гене ADARB2 и пять SNP в гене ADARB1 коррелируют с увеличенной продолжительностью жизни долгожителей[48], но поскольку изучить роль этих элементов в организме человека трудно, исследователи стали экспериментировать с C. elegans. Мы не знаем, усиливают ли эти SNP активность данной системы в клетках человека или ее ослабляют, но известно, что мутации генов adr-1 и adr-2 укорачивают жизнь как нематод дикого типа, так и мутантов daf-2. Потеря гена rde-1, необходимого для РНК-интерференции, восстанавливала продолжительность жизни двойных мутантов до продолжительности жизни червей дикого типа, но мы не знаем механизма этого явления, как не знаем и причину связи между SNP в генах ADAR и человеческим долголетием. Позднее выяснилось, что SNP в гене ADARB2 имеют отношение к метаболическим нарушениям, вероятно, через регуляцию уровня адипонектина в сыворотке (иными словами, ADARB2 влияет на метаболизм жиров и связан с повышением ИМТ и другими изменениями висцеральных жиров)[49].
Кольцевые молекулы РНК – давно известный, но почти забытый вид РНК, который недавно вновь оказался в центре внимания исследователей (скажем так, кольцо замкнулось) в связи с их возможной ролью в старении. Кольцевая РНК есть у растений, грибов и животных, включая человека. Считается, что такие молекулы возникают как побочный продукт сплайсинга, и это согласуется с их накоплением с возрастом фактически у любых организмов[50]. У дрозофил с мутациями инсулинового пути кРНК накапливаются с возрастом медленнее, чем у животных дикого типа[51], но как минимум один вариант кРНК может продлевать жизнь. Некоторые из этих функциональных молекул действуют через трансляцию в пептиды, тогда как другие выступают в роли антагонистов микроРНК[52], что указывает на существование ранее не исследованного уровня регуляции, который необходимо учесть.
Контроль качества клеточных элементов играет важнейшую роль в определении продолжительности жизни клеток и организмов, и с помощью очистки клеток организм поддерживает свои функции так долго, как только возможно. РНК – центральный элемент клетки, и поэтому вполне вероятно, что в ближайшие годы мы обнаружим, что все этапы контроля качества РНК важны для здоровья клетки, ослабевают с возрастом и поддерживаются в некоторых условиях, способствующих увеличению продолжительности жизни, – как мы уже обнаружили в отношении всех этапов жизни белка. Следовательно, вопрос ставится таким образом: как влиять на эти механизмы контроля качества, чтобы они как можно дольше оставались “включенными” при старении? По-видимому, ни один механизм гомеостаза белков или РНК не является полностью определяющим для процессов старения, но усиление некоторых самых важных из этих процессов на поздних этапах жизни (особенно если это сочетается с контролем качества других макромолекул и механизмов регенерации) может быть мощным инструментом для замедления старения.
Если мы позволим санитарным службам как можно дольше выполнять свою работу, это поможет всем нам, и потому следует их ценить.