С развитием секвенирования генома и обилием подробных клеточных данных возможность моделировать более простые организмы, такие как микоплазмы, стала практической реальностью. Идея Моровица получила развитие в 1995 г., когда Mycoplasma genitalium, обитающая в половых путях человека, стала вторым свободноживущим организмом, генетический код которого был прочитан или секвенирован в ходе исследований американского пионера геномики Крейга Вентера[348].
Одну попытку превратить это молекулярное понимание в «электронную клетку» предпринял Масару Томита из Университета Кэйо, Фудзисава, Япония[349]. Весной 1996 г., работая под руководством Томиты, студенты Лаборатории биоинформатики в Кэйо нарисовали сеть метаболических взаимодействий, основанную всего на 120 генах Mycoplasma – существенное упрощение, поскольку реальная на самом деле зависит от 525 генов. Более того, они также позаимствовали 7 генов у бактерии E. coli, чтобы заставить свою виртуальную клетку работать[350].
Эта модель, опубликованная три года спустя, включала метаболизм, транскрипцию и трансляцию генов. Описывая клеточный метаболизм с помощью набора обыкновенных дифференциальных уравнений, они использовали объектно-ориентированное программирование для транскрипции и трансляции, где клеточные данные представлялись как дискретные объекты, с которыми может взаимодействовать пользователь и другие объекты. Команда разработала сотни правил, регулирующих метаболические пути: от гликолиза и транскрипции генов до синтеза белка. Для большей реалистичности ферменты и другие белки в их модели изящно «деградировали», так что их приходилось постоянно синтезировать, чтобы клетка могла поддерживать «жизнь».
Японская команда могла экспериментировать на своей виртуальной клетке, поскольку их «движок-симулятор» работал примерно на одной двадцатой темпа жизни реальной клетки. Состояние виртуальной клетки в каждый момент выражалось в виде концентраций входящих в нее веществ, а также значений объема клетки, кислотности (pH) и температуры. Они могли выбить ген и изучить последствия, даже «убить» свою виртуальную клетку, отключив важный ген, например, отвечающий за синтез белка.
Они добились значительного прогресса и опубликовали свою модель в 1999 г. Однако существовало еще много генов, функции которых не были известны. Также было сложно построить последовательную модель из обыкновенных дифференциальных уравнений. Еще одной проблемой был поиск всех параметров, которые можно включить в эти уравнения. Под руководством Коичи Такахаси из Лаборатории биологических вычислений в Осаке команда перешла к моделированию других клеток, таких как эритроциты и кардиомиоциты. Чтобы избежать рутины по сбору данных из тысяч статей для моделирования более сложных клеток, команда использует ИИ для извлечения геномных последовательностей из баз данных, прогнозирования, какие части последовательности транслируются в белки, и использования существующих знаний для определения того, что они делают и как взаимодействуют.
Совсем недавно еще одна виртуальная Mycoplasma genitalium появилась на компьютере благодаря системному биологу из Стэнфордского университета Маркусу Коверту, который сам был вдохновлен идеями Бреннера, Крика и Моровица, а также данными Вентера. Будучи аспирантом, в 1995 г. Коверт увлекся первым исследованием сравнительной геномики, когда команда Вентера сопоставила генетический код бактерий Mycoplasma pneumoniae и Haemophilus influenzae, чтобы начать разработку основного набора генов, необходимых для жизни[351]. Коверт до сих пор помнит охватившее его волнение, когда в газете он прочитал слова Клайда Хатчисона, члена команды Вентера: работающая компьютерная модель клетки станет окончательным испытанием биологического понимания.
Эти слова навсегда останутся с Ковертом, который шел за мечтой. Его команда использовала код ДНК микоплазмы Вентера вместе с данными, полученными из более чем 900 научных работ, включая почти 2000 экспериментально наблюдаемых параметров, которые отражают геном организма, транскриптом, протеом, метаболом и т. д. Они разделили M.genitalium на 28 функциональных процессов, моделируя каждый независимо в течение 1 с. Целая клетка была смоделирована с использованием алгоритма, сравнимого с теми, которые используются для численного интегрирования обыкновенных дифференциальных уравнений.
Изменение состояния виртуальной клетки рассчитывалось секунда за секундой путем многократного распределения переменных состояния между процессами, выполнения каждой из подмоделей клеточных процессов и обновления значений переменных состояния до тех пор, пока не было достигнуто заданное время или клетка не делилась. В целом модель сочетала в себе смесь булевой алгебры (сочетание логики и математики, сыгравшей ключевую роль в создании компьютеров), линейной оптимизации и обыкновенных дифференциальных уравнений, чтобы «оживить» организм.
Сложнее всего было объединить 28 функциональных процессов в единую клеточную модель. Исследователи начали с предположения, что эти процессы независимы на коротких временных интервалах – в данном случае менее 1 с. Моделирование проводилось в цикле, в котором модели подпроцессов запускались независимо на каждом временном шаге, но зависели от значений переменных, определенных другими подмоделями на предыдущем временном шаге. Таким образом, им удалось смоделировать M.genitalium до каждого из 525 генов, что стало первым моделированием всех генов организма и каждой известной функции генов.
К 2012 г. команда из Стэнфорда сообщила о первой модели бактерии, учитывавшей все известные функции генов, и заявила, что проблема понимания того, как сложные фенотипы возникают из отдельных молекул и их взаимодействий, теперь может быть решена с помощью виртуальных клеток[352]. Когда они представили свою виртуальную бактерию, моделирование деления одной клетки заняло около 10 ч и сгенерировало полгигабайта данных. «Хотите верьте, хотите нет, но для деления настоящей клетки M.genitalium также требуется около 10 часов», – сказал нам Коверт[353].
Команда из Стэнфорда использовала этот виртуальный организм, чтобы выяснить детали клеточного цикла, который состоит из трех стадий – инициации, репликации и цитокинеза (деление клеток). Отсылая к реальному миру, продолжительность отдельных стадий виртуальных клеточных циклов варьировалась, в то время как продолжительность цикла в целом была относительно постоянной. Они обнаружили, что клетки, которым требовалось больше времени, чтобы начать репликацию ДНК, успели накопить пул свободных нуклеотидов – строительных блоков ДНК. В результате репликация цепей ДНК из этих нуклеотидов затем проходила относительно быстро. И напротив, клетки, которые прошли начальный этап быстрее, не имели избытка нуклеотидов, что задерживало репликацию.
Модель дает различную информацию, показывая, как хромосома связывается по крайней мере с одним белком в течение первых 6 мин клеточного цикла. Они смогли выяснить, что около 90 % генов были использованы или экспрессированы в течение первых 143 мин клеточного цикла и что в течение каждого цикла происходит 30 000 взаимодействий между белками. С помощью компьютера они смогли смоделировать последствия разрушения каждого из 525 генов в тысячах симуляций. Это показало, что 284 гена необходимы для поддержания роста и деления M.genitalium, а 117 из них несущественны, что в целом согласуется с экспериментальными данными[354]. Отключение метаболических генов вызвало наибольшие нарушения. При отключении синтеза определенного компонента клетки, такого как РНК или белок, модель предсказывала почти нормальный рост, за которым следовал спад.
Исследователи нашли захватывающие примеры избыточности. Согласно модели, удаление гена lpdA должно убить клетку. Однако эксперименты показали, что этот штамм остается жизнеспособным, хотя и растет на 40 % медленнее. Они пришли к выводу, что работу этого гена компенсирует другая клеточная подсистема. И действительно, команда обнаружила, что другой ген, Nox, выполняет функцию, аналогичную lpdA. Когда они скорректировали виртуальную клетку, смоделировав дополнительное использование Nox, в результате получилась жизнеспособная симулированная клетка. «Мы были удивлены способностью этих моделей предсказывать поведение на молекулярном уровне, впоследствии подтвержденное экспериментально», – сказал Коверт. Это впечатляет, хотя команда подчеркнула, что модель была лишь «первым наброском».
Одно из ключевых открытий, которое пришло к нам, в частности, от аспирантки Коверта Джайодиты Сангви, заключалось в возможности исходить из общего поведения виртуальных клеток (например, влияния разрушения генов на скорость роста), чтобы предсказать, что происходит на уровне ферментов, а не прибегать к данным об этих ферментах из других организмов, таких как E. coli[355]. «Это действительно невероятное достижение, которое часто недооценивают, – заметил Коверт. – Ранее работа заключалась в запуске симуляций, и эти симуляции были самоцелью. Работа Джайодиты была первой проведенной над клетками, в которой была показана точность как общих, так и очень детальных предсказаний модели. Впервые увидев результаты, я не мог поверить, – для меня эти новые данные были таким же Святым Граалем, как и сама модель!»[356]
Этот подход может стать благом для усилий по адаптации микроорганизмов для новых целей, будь то производство лекарств или топлива, а также для содействия усилиям по созданию синтетических клеток. В рамках применения технологии рекомбинантной ДНК и генной инженерии, направленной на идентификацию фундаментальных генов жизни и занявшей почти десятилетие, в 2016 г. команда Крейга Вентера объявила, что они создали в лаборатории хромосому и варианты M.genitalium и трансплантировали их в пустую бактериальную оболочку для получения синтетической клетки[357].
Эта виртуальная бактерия с ее 525 генами была только началом. Они автоматизировали процесс с помощью так называемого сборочного робота Gibson (названного в честь коллеги Вентера Дэна Гибсона[358]). В долгосрочной перспективе модели виртуальных клеток могут привести к рациональному проектированию новых микроорганизмов. Вентер, который подчеркнул, что работа Коверта была «фантастической», сказал нам, что в настоящее время возможности ограничены, потому что для полного понимания функции генов еще многое предстоит сделать: даже в случае маленькой M.genitalium роль трети генов изначально была неизвестна. Однако он добавил, что виртуальные клетки обладают «огромной полезностью», когда дело доходит до раскрытия этих деталей[359].
В качестве примера было проведено моделирование минимальной синтетической бактериальной клетки JCVI-syn3A, урезанного организма всего с 93 генами, созданного Институтом Дж. Крейга Вентера (JCVI) и Synthetic 4 Genomics, Inc. Клайд Хатчисон, Зайда (Зан) Люти-Шультен и коллеги из Университета Иллинойса в Урбане-Шампейне построили 3D-модель примерно двух миллиардов атомов, раскрывающих связи между метаболизмом, генетической информацией и ростом клеток, включая 148 известных метаболитов, 452 белка, 503 рибосомы и более 7000 реакций ДНК. Модель использовала графические процессоры для моделирования 20-минутного периода клеточного цикла – одного из самых длинных и сложных в своем роде на сегодняшний день. Обнадеживает тот факт, что модель показала: клетка тратит большую часть энергии на транспортировку молекул через свою мембрану, чего и следовало ожидать, учитывая, что это паразитическая клетка, и фундаментальное «эмерджентное поведение подтверждается несколькими экспериментальными результатами»[360].